Faleminderit që vizituat Nature.com. Versioni i shfletuesit që po përdorni ka mbështetje të kufizuar CSS. Për rezultate më të mira, ne ju rekomandojmë të përdorni një version më të ri të shfletuesit tuaj (ose të çaktivizoni Modalitetin e Përputhshmërisë në Internet Explorer). Ndërkohë, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne po e shfaqim faqen pa stilizim ose JavaScript.
Zbulimi dhe përdorimi i dobishëm i produkteve natyrore mund të ndihmojë në përmirësimin e jetës njerëzore. Kimikatet që frenojnë rritjen e bimëve përdoren gjerësisht si herbicide për të kontrolluar barërat e këqija. Për shkak të nevojës për të përdorur lloje të ndryshme herbicidesh, ekziston nevoja për të identifikuar komponime me mekanizma të rinj veprimi. Në këtë studim, zbuluam një përbërje të re N-alkoksipiroli, kumamonamid, nga Streptomyces werraensis MK493-CF1 dhe krijuam procesin e plotë të sintezës. Përmes analizave të aktivitetit biologjik, zbuluam se acidi urs-monoamik është një ndërmjetës sintetik i urs-monoamidit dhe një potencial...frenues i rritjes së bimëvePërveç kësaj, ne kemi zhvilluar derivate të ndryshme të acidit urbenonik, duke përfshirë derivatin urbeniloksi (UDA), i cili ka aktivitet të lartë herbicid pa ndikuar negativisht në rritjen e qelizave HeLa. Gjithashtu zbuluam se derivatet e acidit urmotonik prishin mikrotubulat e bimëve; përveç kësaj, KAND ndikon në filamentet e aktinës dhe shkakton vdekjen e qelizave; Këto efekte shumëplanëshe ndryshojnë nga ato të frenuesve të njohur të mikrotubulave dhe sugjerojnë një mekanizëm të ri veprimi për acidin ursonik, i cili përfaqëson një avantazh të rëndësishëm në zhvillimin e herbicideve të reja.
Zbulimi dhe zbatimi praktik i produkteve të dobishme natyrore dhe derivateve të tyre është një mjet për përmirësimin e cilësisë së jetës njerëzore. Metabolitët sekondarë të prodhuar nga mikroorganizmat, bimët dhe insektet kanë çuar në përparime të mëdha në mjekësi dhe bujqësi. Shumë antibiotikë dhe ilaçe kundër leuçemisë janë zhvilluar nga produktet natyrore. Përveç kësaj, lloje të ndryshme tëpesticide, fungicidet dhe herbicidet nxirren nga këto produkte natyrore për përdorim në bujqësi. Në veçanti, herbicidet për kontrollin e barërave të këqija janë mjete të rëndësishme për rritjen e rendimenteve të të korrave në bujqësinë moderne, dhe lloje të ndryshme të komponimeve përdoren tashmë komercialisht. Disa procese qelizore në bimë, të tilla si fotosinteza, metabolizmi i aminoacideve, sinteza e murit qelizor, rregullimi i mitozës, sinjalizimi i fitohormoneve ose sinteza e proteinave, konsiderohen objektiva tipike të herbicideve. Komponimet që pengojnë funksionin e mikrotubulave janë një klasë e zakonshme e herbicideve që ndikojnë në rritjen e bimëve duke ndikuar në rregullimin mitotik2.
Mikrotubulat janë përbërës të citoskeletit dhe janë të ruajtura gjerësisht në qelizat eukariote. Heterodimeri i tubulinës përbëhet nga α-tubulina dhe β-tubulina që formojnë protofilamente lineare të mikrotubulave, me 13 protofilamente që formojnë një strukturë cilindrike. Mikrotubulat luajnë role të shumëfishta në qelizat bimore, duke përfshirë përcaktimin e formës së qelizës, ndarjen qelizore dhe transportin intraqelizor3,4. Qelizat bimore përmbajnë mikrotubula nën membranën plazmatike ndërfazore, dhe këto të ashtuquajtura mikrotubula kortikale mendohet se kontrollojnë organizimin e mikrofibrileve të celulozës përmes rregullimit të komplekseve të sintazës së celulozës4,5. Mikrotubulat kortikale të qelizave epidermale të rrënjës, të pranishme në zonën e zgjatjes së shpejtë të majës së rrënjës, janë të vendosura anash, dhe mikrofibrat e celulozës ndjekin këto mikrotubula dhe kufizojnë drejtimin e zgjerimit të qelizave, duke nxitur kështu zgjatjen anizotropike të qelizave. Prandaj, funksioni i mikrotubulave është i lidhur ngushtë me morfologjinë e bimëve. Zëvendësimet e aminoacideve në gjenet që kodojnë tubulinën shkaktojnë shtrembërim të vargjeve të mikrotubulave kortikale dhe rritje në anën e majtë ose të djathtë në Arabidopsis 6,7. Në mënyrë të ngjashme, mutacionet në proteinat e shoqëruara me mikrotubulat që rregullojnë dinamikën e mikrotubulave mund të çojnë gjithashtu në rritje të shtrembëruar të rrënjëve8,9,10,11,12,13. Përveç kësaj, trajtimi me herbicide që prishin mikrotubulat, siç është disopiramida, e njohur edhe si pretilaklor, shkakton gjithashtu rritje të rrënjës së zhdrejtë në anën e majtë14. Këto të dhëna tregojnë se rregullimi i saktë i funksionit të mikrotubulave është kritik për përcaktimin e drejtimit të rritjes së bimëve.
Janë zbuluar lloje të ndryshme të frenuesve të mikrotubulave, dhe këto barna kanë dhënë kontribute të rëndësishme në kërkimin e citoskeletit, si dhe në bujqësi dhe mjekësi2. Në veçanti, orizalina, komponimet dinitroaniline, disopiramida, komponimet e lidhura me benzamidin dhe analogët e tyre mund të pengojnë funksionin e mikrotubulave dhe në këtë mënyrë të pengojnë rritjen e bimëve. Prandaj, ato përdoren gjerësisht si herbicide. Megjithatë, meqenëse mikrotubulat janë një përbërës i rëndësishëm i qelizave bimore dhe shtazore, shumica e frenuesve të mikrotubulave janë citotoksikë për të dy llojet e qelizave. Prandaj, pavarësisht dobisë së tyre të njohur si herbicide, një numër i kufizuar agjentësh antimikrotubularë përdoren për qëllime praktike.
Streptomyces është një gjini e familjes Streptomyces, e cila përfshin baktere aerobe, gram-pozitive, filamentoze dhe është e njohur gjerësisht për aftësinë e saj për të prodhuar një gamë të gjerë metabolitësh sekondarë. Prandaj, konsiderohet si një nga burimet më të rëndësishme të produkteve të reja natyrore biologjikisht aktive. Në studimin aktual, zbuluam një përbërës të ri të quajtur kumamonamide, i cili u izolua nga Streptomyces werraensis MK493-CF1 dhe S. werraensis ISP 5486. Duke përdorur analizën spektrale dhe analizën e plotë spektrale, u karakterizua struktura e kumamonamidit dhe u përcaktua skeleti i tij unik N-alkoksipirol. Acidi ursmonik, një ndërmjetës sintetik i ursmonoamidit dhe derivateve të tij, u gjet se pengon rritjen dhe mbirjen e bimës model të njohur Arabidopsis thaliana. Në një studim të marrëdhënies strukturë-aktivitet, zbuluam se një përbërës me C9 të modifikuar në acid ursonik, i quajtur derivat noniloksi i acidit ursonik (KAND), rrit ndjeshëm efektin frenues në rritje dhe mbirje. Veçanërisht, frenuesi i rritjes së bimëve i zbuluar rishtazi ndikoi gjithashtu në rritjen e duhanit dhe të mëlçisë dhe nuk ishte citotoksik për bakteret ose qelizat HeLa. Për më tepër, disa derivate të acidit urmotonik shkaktojnë një fenotip të shtrembëruar të rrënjës, duke nënkuptuar se këto derivate ndikojnë drejtpërdrejt ose tërthorazi në mikrotubula. Në përputhje me këtë ide, vëzhgimet tona të mikrotubulave të etiketuara ose imunohistokimikisht ose me proteina fluoreshente tregojnë se trajtimi me KAND depolimerizon mikrotubulat. Përveç kësaj, trajtimi me derivate të acidit kumamotonik prishi mikrofilamentet e aktinës. Kështu, ne kemi zbuluar një frenues të ri të rritjes së bimëve, mekanizmi unik i veprimit të të cilit përfshin shkatërrimin e citoskeletit.
Shtami MK493-CF1 u izolua nga toka në Shinagawa-ku, Tokio. Shtami MK493-CF1 formoi micelium stromal të degëzuar mirë. U përcaktua sekuenca e pjesshme e gjenit 16S të ARN-së ribozomale (1422 bp). Ky lloj është shumë i ngjashëm me S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: lloj tipik, 99.93%). Bazuar në këtë rezultat, u përcaktua se ky lloj ishte i lidhur ngushtë me llojin e S. werraensis. Prandaj, ne e quajtëm përkohësisht këtë lloj S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T gjithashtu prodhon të njëjtat komponime bioaktive. Meqenëse kishte pak kërkime të hershme për të marrë produkte natyrale nga ky mikroorganizëm, u kryen kërkime të mëtejshme kimike. Pas kultivimit të S. werraensis MK493-CF1 në mjedis elbi me anë të fermentimit në gjendje të ngurtë në 30°C për 14 ditë, mjedisi u ekstraktua me 50% EtOH. 60 ml mostër u tha për të marrë 59.5 mg ekstrakt të papërpunuar. Ekstrakti i papërpunuar iu nënshtrua HPLC-së me fazë të kundërt për të dhënë N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamidë (1, i quajtur kumamonamidë, 36.0 mg). Sasia totale e 1 është afërsisht 60% e ekstraktit të papërpunuar. Prandaj, vendosëm të studiojmë në detaje vetitë e kumamotoamidës 1.
Kumamonamidi 1 është një pluhur amorf i bardhë dhe spektrometria masive me rezolucion të lartë (HRESIMS) konfirmon C6H8N2O2 (Fig. 1). Fragmenti i pirolit i zëvendësuar me C2 i këtij përbërësi karakterizohet nga δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH në spektrin 1H NMR: 4.5 Hz, H-5) dhe δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), dhe spektri 13C NMR tregon praninë e katër atomeve të karbonit sp2. Prania e një grupi amid në pozicionin C2 u vlerësua me anë të korrelacionit HMBC nga protoni C-3 tek karboni karbonil i amidit në δC 161.1. Përveç kësaj, majat e 1H dhe 13C NMR në δH 4.10 (3H, S) dhe δC 68.3 tregojnë praninë e grupeve N-metoksi në molekulë. Edhe pse pozicioni i saktë i grupit metoksi nuk ishte përcaktuar ende duke përdorur analiza spektroskopike siç është spektroskopia e ndryshimit të zgjeruar dhe shkurtimi bërthamor Overhauser (NOEDF), N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamidi u bë përbërja e parë kandidate.
Për të përcaktuar strukturën e saktë të 1, u krye një sintezë totale (Fig. 2a). Trajtimi i 2-aminopiridinës 2 të disponueshme në treg me m-CPBA rezultoi në N-oksidin përkatës 3 në rendiment sasior. Pas 2-aminoazidimit të 2, reaksioni i ciklokondensimit i përshkruar nga Abramovich u krye në benzen në 90°C për të marrë 1-hidroksi-1H-pirol-2-karbonitrilin 5 të dëshiruar në gram. Shpejtësia 60% (dy faza). 15,16. Metilimi dhe hidroliza e 4 më pas dhanë acidin 1-metoksi-1H-pirol-2-karboksilik (i quajtur "acid kumotonik", 6) në rendiment të mirë (70%, dy hapa). Së fundmi, amidimi nëpërmjet ndërmjetësit të klorurit të acidit 6 duke përdorur amoniak ujor dha amidin Kumamoto 1 me rendiment 98%. Të gjitha të dhënat spektrale të 1 të sintetizuar ishin të ngjashme me 1 të izoluar, kështu që u përcaktua struktura e 1;
Sinteza dhe analiza e përgjithshme e aktivitetit biologjik të urbenamidit dhe acidit urbenik. (a) Sinteza totale e amidit Kumamoto. (b) Fidanët shtatëditorë të Arabidopsis Columbia (Col) të tipit të egër u rritën në pllaka Murashige dhe Skoog (MS) që përmbanin kumamonamide 6 ose kumamonamide 1 në përqendrimet e treguara. Shiriti i shkallës = 1 cm.
Së pari, ne vlerësuam aktivitetet biologjike të urbenamidës dhe ndërmjetësve të saj për aftësinë e tyre për të moduluar rritjen e bimëve. Ne shtuam përqendrime të ndryshme të ursmonamidës 1 ose acidit ursmonik 6 në mjedisin MS agar dhe kultivuam fidanë të Arabidopsis thaliana në këtë mjedis. Këto analiza treguan se përqendrimet e larta (500 μM) të 6 penguan rritjen e rrënjëve (Fig. 2b). Më pas, ne gjeneruam derivate të ndryshme duke zëvendësuar pozicionin N1 të 6 dhe kryem studime të marrëdhënies strukturë-aktivitet mbi to (procesi i sintezës analoge përshkruhet në Informacionin Mbështetës (SI)). Fidanët e Arabidopsis u rritën në një mjedis që përmbante 50 μM derivate të acidit ursonik dhe u mat gjatësia e rrënjës, siç tregohet në figurë. Siç tregohet në Figurat 3a, b dhe S1, acidet kumamo kanë gjatësi të ndryshme të zinxhirëve alkoksi linearë (9, 10, 11, 12 dhe 13) ose zinxhirë të mëdhenj alkoksi (15, 16 dhe 17) në pozicionin N1. Derivatet treguan frenim të konsiderueshëm të rritjes së rrënjëve. Përveç kësaj, zbuluam se aplikimi i 200 μM 10, 11 ose 17 pengoi mbirjen (Fig. 3c dhe S2).
Studimi i marrëdhënies strukturë-aktivitet i amidit Kumamoto dhe komponimeve të lidhura. (a) Skema e strukturës dhe sintezës së analogëve. (b) Kuantifikimi i gjatësisë së rrënjës së fidanëve 7-ditorë të rritur në medium MS me ose pa derivate kumamonamid 50 μM. Yjet tregojnë ndryshime të rëndësishme me trajtimin e rremë (testi t, p< 0.05). n>18. Të dhënat tregohen si mesatare ± SD. nt do të thotë "nuk është testuar" sepse më shumë se 50% e farërave nuk mbinë. (c) Përcaktimi sasior i shkallës së mbirjes së farërave të trajtuara të inkubuara për 7 ditë në mjedis MS me ose pa 200 μM kumanonamide dhe komponime të ngjashme. Yjet tregojnë ndryshime të rëndësishme me trajtimin e rremë (testi ki-katror). n=96.
Është interesante se shtimi i zinxhirëve anësorë alkilë më të gjatë se C9 uli aktivitetin frenues, duke sugjeruar që komponimet e lidhura me acidin kumamotoik kërkojnë zinxhirë anësorë të një madhësie të caktuar për të shfaqur aktivitetin e tyre biologjik.
Meqenëse analiza e marrëdhënies strukturë-aktivitet tregoi se C9 ishte modifikuar në acid ursonik dhe derivati noniloksi i acidit ursonik (në tekstin e mëtejmë i referuar si KAND 11) ishte frenuesi më efektiv i rritjes së bimëve, ne kryem një karakterizim më të detajuar të KAND 11. Trajtimi i Arabidopsis me 50 μM KAND 11 pothuajse plotësisht parandaloi mbirjen, ndërsa përqendrimet më të ulëta (40, 30, 20 ose 10 μM) të KAND 11 penguan rritjen e rrënjëve në një mënyrë të varur nga doza (Fig. 4a, b). Për të testuar nëse KAND 11 ndikon në qëndrueshmërinë e meristemit të rrënjës, ne shqyrtuam meristemet e rrënjës të ngjyrosura me jodur propidiumi (PI) dhe matëm madhësinë e sipërfaqes së meristemit. Madhësia e meristemit të fidanëve të rritur në një medium që përmbante 25 μM KAND-11 ishte 151.1 ± 32.5 μm, ndërsa madhësia e meristemit të fidanëve të rritur në një medium kontrolli që përmbante DMSO ishte 264.7 ± 30.8 μm (Fig. 4c, d), gjë që tregon se KAND-11 rikthen aktivitetin qelizor. Meristemi i rrënjës. Në përputhje me këtë, trajtimi me KAND 11 uli sasinë e sinjalit të shënuesit të ndarjes qelizore CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS në meristemin e rrënjës (Fig. 4e) 17. Këto rezultate tregojnë se KAND 11 pengon rritjen e rrënjës duke zvogëluar aktivitetin e përhapjes së qelizave.
Analiza e efektit frenues të derivateve të acidit urbenonik (derivateve të urbeniloksit) në rritje. (a) Fidanë Col të tipit të egër 7-ditorë të rritur në pllaka MS me përqendrimet e treguara të KAND 11. Shiriti i shkallës = 1 cm. (b) Kuantifikimi i gjatësisë së rrënjës. Shkronjat tregojnë ndryshime të rëndësishme (testi Tukey HSD, f.< 0.05). n>16. Të dhënat tregohen si mesatare ± SD. (c) Mikroskopi konfokale e rrënjëve të tipit të egër Col të ngjyrosura me jodur propidiumi të rritura në pllaka MS me ose pa 25 μM KAND 11. Kllapat e bardha tregojnë meristemin e rrënjës. Shiriti i shkallës = 100 µm. (d) Kuantifikimi i madhësisë së meristemit të rrënjës (n = 10 deri në 11). Dallimet statistikore u përcaktuan duke përdorur testin t (p< 0.05). Shiritat përfaqësojnë madhësinë mesatare të meristemit. (e) Mikroskopia me kontrast interference diferenciale (DIC) e një meristemi rrënjor që përmban konstruktin CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS i ngjyrosur dhe i ngjyrosur në fidanë 5-ditorë të rritur në pllaka MS me ose pa analizën KAND 25 µM.
Fitotoksiciteti i KAND 11 u testua më tej duke përdorur një bimë tjetër dikotiledone, duhanin (Nicotiana tabacum), dhe një organizëm model të madh të bimëve tokësore, mëlçinë (Marchantia polymorpha). Ashtu si në rastin e Arabidopsis, fidanët e duhanit SR-1 të rritur në medium që përmbante 25 μM KAND 11 prodhuan rrënjë më të shkurtra (Fig. 5a). Përveç kësaj, 40 nga 48 fara mbinë në pllaka që përmbanin 200 μM KAND 11, ndërsa të gjitha 48 farat mbinë në medium të trajtuar simulues, duke treguar se përqendrimet më të larta të KAND ishin të rëndësishme (p< 0.05; testi chi -katror) pengoi mbirjen e duhanit. (Fig. 5b). Përveç kësaj, përqendrimi i KAND 11 që pengoi rritjen bakteriale në mëlçi ishte i ngjashëm me përqendrimin efektiv në Arabidopsis (Fig. 5c). Këto rezultate tregojnë se KAND 11 mund të pengojë rritjen e një shumëllojshmërie bimësh. Më pas ne hetuam citotoksicitetin e mundshëm të komponimeve të lidhura me monoamidin e ariut në organizma të tjerë, përkatësisht qelizat HeLa njerëzore dhe lloji Escherichia coli DH5α, si përfaqësues të qelizave të kafshëve të larta dhe bakteriale, përkatësisht. Në një seri analizash të përhapjes së qelizave, ne vumë re se kumamonamidi 1, acidi kumamonamidik 6 dhe KAND 11 nuk ndikuan në rritjen e qelizave HeLa ose E. coli në përqendrime prej 100 μM (Fig. 5d,e).
Frenimi i rritjes së KAND 11 në organizmat jo-Arabidopsis. (a) Fidanët e duhanit SR-1 të tipit të egër dy-javësh u rritën në pllaka MS të pozicionuara vertikalisht që përmbanin 25 μM KAND 11. (b) Fidanët e duhanit SR-1 të tipit të egër dy-javësh u rritën në pllaka MS të pozicionuara horizontalisht që përmbanin 200 μM KAND 11. (c) Sythat e mëlçisë Tak-1 të tipit të egër dy-javësh të rritura në pllaka Gamborg B5 me përqendrimet e treguara të KAND 11. Shigjetat e kuqe tregojnë sporet që ndaluan së rrituri brenda periudhës dy-javore të inkubacionit. (d) Analiza e përhapjes së qelizave të qelizave HeLa. Numri i qelizave të qëndrueshme u mat në intervale kohore të fiksuara duke përdorur një kit numërimi të qelizave 8 (Dojindo). Si kontroll, qelizat HeLa u trajtuan me 5 μg/ml aktinomicinë D (Act D), e cila pengon transkriptimin e ARN polimerazës dhe shkakton vdekjen e qelizave. Analizat u kryen në trefish. (e) Analiza e përhapjes së qelizave E. coli. Rritja e E. coli u analizua duke matur OD600. Si kontroll, qelizat u trajtuan me 50 μg/ml ampicilin (Amp), e cila pengon sintezën e murit qelizor bakterial. Analizat u kryen në trefish.
Për të deshifruar mekanizmin e veprimit të citotoksicitetit të shkaktuar nga komponimet e lidhura me uramidin, ne rianalizuam derivatet e acidit urbenik me efekte frenuese të moderuara, siç tregohet në figurë. Siç tregohet në Figurat 2b, 6a, fidanët e rritur në pllaka agari që përmbanin përqendrime të larta (200 μM) të acidit urmotonik 6 prodhuan rrënjë më të shkurtra dhe të lakuara majtas (θ = – 23.7 ± 6.1), ndërsa nga fidanët e rritur në mjedisin e kontrollit, fidanët prodhuan rrënjë pothuajse të drejta (θ = – 3.8 ± 7.1). Kjo rritje karakteristike e pjerrët dihet se rezulton nga mosfunksionimi i mikrotubulave kortikale14,18. Në përputhje me këtë gjetje, ilaçet disopiramida dhe orizalina që destabilizojnë mikrotubulat shkaktuan anim të ngjashëm të rrënjëve në kushtet tona të rritjes (Fig. 2b, 6a). Në të njëjtën kohë, ne testuam derivatet e acidit urmotonik dhe përzgjodhëm disa prej tyre që, në përqendrime të caktuara, shkaktuan rritje të pjerrët të rrënjëve. Komponimet 8, 9 dhe 15 ndryshuan drejtimin e rritjes së rrënjës në 75 μM, 50 μM dhe 40 μM, përkatësisht, duke treguar se këto komponime mund të destabilizojnë në mënyrë efektive mikrotubulat (Fig. 2b, 6a). Ne gjithashtu testuam derivatin më të fuqishëm të acidit ursolik, KAND 11, në një përqendrim më të ulët (15 μM) dhe zbuluam se aplikimi i KAND 11 pengonte rritjen e rrënjës dhe se drejtimi i rritjes së rrënjës ishte i pabarabartë, megjithëse ato tentonin të anonin majtas (Figura C3). . Meqenëse përqendrimet më të larta të barnave destabilizuese të mikrotubulave ndonjëherë pengojnë rritjen e bimëve në vend që të shkaktojnë anim të rrënjës, ne më pas vlerësuam mundësinë që KAND 11 të ndikojë në mikrotubula duke vëzhguar mikrotubulat kortikale në qelizat epidermale të rrënjës. Imunohistokimia duke përdorur antitrupa anti-β-tubulinë në qelizat epidermale të rrënjëve të fidanëve të trajtuara me 25 μM KAND 11 tregoi zhdukjen e pothuajse të gjitha mikrotubulave kortikale në qelizat epidermale në zonën e zgjatjes (Fig. 6b). Këto rezultate tregojnë se acidi kumamotonik dhe derivatet e tij veprojnë drejtpërdrejt ose tërthorazi në mikrotubula duke i prishur ato dhe se këto komponime janë frenues të rinj të mikrotubulave.
Acidi ursonik dhe derivatet e tij ndryshojnë mikrotubulat kortikale në Arabidopsis thaliana. (a) Këndi i prirjes së rrënjës i matur në prani të derivateve të ndryshme të acidit urmotonik në përqendrimet e treguara. U analizuan gjithashtu efektet e dy komponimeve të njohura për frenimin e mikrotubulave: disopiramida dhe orizalina. Figura e brendshme tregon standardin e përdorur për të matur këndin e rritjes së rrënjës. Yjet tregojnë ndryshime të rëndësishme me trajtimin e rremë (testi t, p< 0.05). n>19. Shiriti i shkallës = 1 cm. (b) Mikrotubulat kortikale në qelizat epidermale në zonën e zgjatjes. Mikrotubulat në rrënjët e Arabidopsis Col të tipit të egër të rritura në pllaka MS me ose pa 25 μM KAND 11 u vizualizuan me anë të ngjyrosjes imunohistokimike duke përdorur antitrupa primarë β-tubulinë dhe antitrupa sekondarë të konjuguar me Alexa Fluor. Shiriti i shkallës = 10 µm. (c) Struktura mitotike e mikrotubulave në meristemin e rrënjës. Mikrotubulat u vizualizuan duke përdorur ngjyrosje imunohistokimike. Strukturat mitotike, duke përfshirë zonat e profazës, boshtet dhe fragmoplastet, u numëruan nga imazhet konfokale. Shigjetat tregojnë strukturat mitotike të mikrotubulave. Yjet tregojnë ndryshime të rëndësishme me trajtimin e rremë (testi t, p< 0.05). n>9. Shiriti i shkallës = 50 µm.
Edhe pse Ursa ka aftësinë të prishë funksionin e mikrotubulave, mekanizmi i veprimit të saj pritet të jetë i ndryshëm nga agjentët tipikë depolimerizues të mikrotubulave. Për shembull, përqendrimet më të larta të agjentëve depolimerizues të mikrotubulave, siç janë disopiramida dhe orizalina, shkaktojnë zgjerim anizotropik të qelizave epidermale, ndërsa KAND 11 jo. Përveç kësaj, bashkë-aplikimi i KAND 11 dhe disopiramidës rezultoi në një përgjigje të kombinuar të rritjes së rrënjëve të shkaktuar nga disopiramida dhe u vu re frenimi i rritjes së shkaktuar nga KAND 11 (Fig. S4). Ne gjithashtu analizuam përgjigjen e mutantit hipersensitiv të disopiramidës 1-1 (phs1-1) ndaj KAND 11. phs1-1 ka një mutacion pikësor jo-kanonik të kinazës së tubulinës dhe prodhon rrënjë më të shkurtra kur trajtohet me disopiramidë9,20. Fidanët mutantë phs1-1 të rritur në mjedis agari që përmbanin KAND 11 kishin rrënjë më të shkurtra të ngjashme me ato të rritura në disopiramidë (fig. S5).
Përveç kësaj, ne vëzhguam strukturat mitotike të mikrotubulave, të tilla si zonat e profazës, boshtet dhe fragmoplastet, në meristemin rrënjor të fidanëve të trajtuar me KAND 11. Në përputhje me vëzhgimet për CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, u vu re një rënie e ndjeshme në numrin e mikrotubulave mitotike (Fig. .6c).
Për të karakterizuar citotoksicitetin e KAND 11 në rezolucionin subqelizor, ne trajtuam qelizat e pezullimit BY-2 të duhanit me KAND 11 dhe vëzhguam përgjigjen e tyre. Së pari shtuam KAND 11 në qelizat BY-2 që shprehin TagRFP-TUA6, i cili etiketon mikrotubulat fluoreshente, për të vlerësuar efektin e KAND 11 në mikrotubulat kortikale. Dendësia e mikrotubulave kortikale u vlerësua duke përdorur analizën e imazhit, e cila përcaktoi përqindjen e pikselave citoskeletorë midis pikselave citoplazmatikë. Rezultatet e analizës treguan se pas trajtimit me 50 μM ose 100 μM KAND 11 për 1 orë, dendësia u ul ndjeshëm në 0.94 ± 0.74% ose 0.23 ± 0.28%, përkatësisht, ndërsa dendësia e qelizave të trajtuara me DMSO arriti në 1.61 ± 0.34% (Fig. 7a). Këto rezultate janë në përputhje me vëzhgimin në Arabidopsis se trajtimi me KAND 11 shkakton depolimerizimin e mikrotubulave kortikale (Fig. 6b). Ne gjithashtu shqyrtuam linjën BY-2 me filamente të aktinës të shënuara me GFP-ABD pas trajtimit me të njëjtin përqendrim të KAND 11 dhe vumë re se trajtimi me KAND 11 prishi filamentet e aktinës. Trajtimi me 50 μM ose 100 μM KAND 11 për 1 orë uli ndjeshëm dendësinë e filamentit të aktinës në 1.20 ± 0.62% ose 0.61 ± 0.26%, përkatësisht, ndërsa dendësia në qelizat e trajtuara me DMSO ishte 1.69 ± 0.51% (Fig. 2). 7b). Këto rezultate bien ndesh me efektet e propizamidit, i cili nuk ndikon në filamentet e aktinës, dhe latrunkulinës B, një depolimerizues i aktinës që nuk ndikon në mikrotubula (Figura SI S6). Përveç kësaj, trajtimi me kumamonamidë 1, acid kumamonamidë 6 ose KAND 11 nuk ndikoi në mikrotubula në qelizat HeLa (Figura SI S7). Kështu, mekanizmi i veprimit të KAND 11 besohet të jetë i ndryshëm nga ai i prishësve të njohur të citoskeletit. Përveç kësaj, vëzhgimi ynë mikroskopik i qelizave BY-2 të trajtuara me KAND 11 zbuloi fillimin e vdekjes qelizore gjatë trajtimit me KAND 11 dhe tregoi se përqindja e qelizave të vdekura të ngjyrosura me blu Evans nuk u rrit ndjeshëm pas 30 minutash trajtimi me KAND 11, ndërsa pas 90 minutash trajtimi me 50 μM ose 100 μM KAND, numri i qelizave të vdekura u rrit në 43.7% ose 80.1%, përkatësisht (Fig. 7c). Të marra së bashku, këto të dhëna tregojnë se derivati i ri i acidit ursolik KAND 11 është një frenues citoskeletor specifik për bimën me një mekanizëm veprimi të panjohur më parë.
KAND ndikon në mikrotubulat kortikale, filamentet e aktinës dhe qëndrueshmërinë e qelizave BY-2 të duhanit. (a) Vizualizimi i mikrotubulave kortikale në qelizat BY-2 në prani të TagRFP-TUA6. Qelizat BY-2 të trajtuara me KAND 11 (50 μM ose 100 μM) ose DMSO u ekzaminuan me mikroskopi konfokale. Dendësia e mikrotubulave kortikale u llogarit nga mikrografitë e 25 qelizave të pavarura. Shkronjat tregojnë ndryshime të rëndësishme (testi Tukey HSD, f.< 0.05). Shiriti i shkallës = 10 µm. (b) Filamentet e aktinës kortikale në qelizat BY-2 të vizualizuara në prani të GFP-ABD2. Qelizat BY-2 të trajtuara me KAND 11 (50 μM ose 100 μM) ose DMSO u ekzaminuan me mikroskop konfokal. Dendësia e filamenteve të aktinës kortikale u llogarit nga mikrografitë e 25 qelizave të pavarura. Shkronjat tregojnë ndryshime të rëndësishme (testi Tukey HSD, f.< 0.05). Shiriti i shkallës = 10 µm. (c) Vëzhgimi i qelizave të vdekura BY-2 me anë të ngjyrosjes me blu Evans. Qelizat BY-2 të trajtuara me KAND 11 (50 μM ose 100 μM) ose DMSO u ekzaminuan me mikroskop me fushë të ndritshme. n=3. Shiriti i shkallës = 100 µm.
Zbulimi dhe aplikimi i produkteve të reja natyrore ka çuar në përparime të konsiderueshme në aspekte të ndryshme të jetës njerëzore, duke përfshirë mjekësinë dhe bujqësinë. Janë kryer kërkime historike për të marrë komponime të dobishme nga burimet natyrore. Në veçanti, aktinomicetet njihen si të dobishme si antibiotikë antiparazitarë për nematodat për shkak të aftësisë së tyre për të prodhuar metabolite të ndryshme sekondare si avermektina, komponimi kryesor i ivermektinës dhe bleomicinës dhe derivateve të saj, të përdorura në mjekësi si një agjent antikancerogjen 21,22. Po kështu, një sërë komponimesh herbicidale janë zbuluar nga aktinomicetet, disa prej të cilave përdoren tashmë komercialisht 1,23. Prandaj, analiza e metabolitëve të aktinomiceteve për të izoluar produktet natyrore me aktivitete biologjike të dëshiruara konsiderohet një strategji efektive. Në këtë studim, zbuluam një komponim të ri, kumamonamid, nga S. werraensis dhe e sintetizuam me sukses. Acidi ursonik është një ndërmjetës sintetik i urbenamidës dhe derivateve të tij. Mund të shkaktojë përdredhje karakteristike të rrënjëve, të shfaqë aktivitet herbicid të moderuar deri të fortë dhe të dëmtojë drejtpërdrejt ose tërthorazi mikrotubulat e bimëve. Megjithatë, mekanizmi i veprimit të acidit urmotonik mund të ndryshojë nga ai i frenuesve ekzistues të mikrotubulave, pasi KAND 11 gjithashtu prish filamentet e aktinës dhe shkakton vdekjen e qelizave, duke sugjeruar një mekanizëm rregullator me anë të të cilit acidi urmotonik dhe derivatet e tij ndikojnë në një gamë të gjerë të strukturave citoskeletore.
Karakterizimi i mëtejshëm i detajuar i acidit urbenonik do të ndihmojë në kuptimin më të mirë të mekanizmit të veprimit të acidit urbenonik. Në veçanti, qëllimi tjetër është të vlerësohet aftësia e acidit ursonik për t'u lidhur me mikrotubulat e reduktuara për të përcaktuar nëse acidi ursonik dhe derivatet e tij veprojnë drejtpërdrejt në mikrotubula dhe i depolimerizojnë ato, apo nëse veprimi i tyre rezulton në destabilizimin e mikrotubulave. Përveç kësaj, në rastin kur mikrotubulat nuk janë një objektiv i drejtpërdrejtë, identifikimi i vendit të veprimit dhe objektivave molekularë të acidit ursonik në qelizat bimore do të ndihmojë në kuptimin e mëtejshëm të vetive të komponimeve të lidhura dhe mënyrave të mundshme për të përmirësuar aktivitetin herbicid. Analiza jonë e bioaktivitetit zbuloi aftësinë unike citotoksike të acidit ursonik në rritjen e bimëve të tilla si Arabidopsis thaliana, duhani dhe liverwort, ndërsa as qelizat E. coli dhe HeLa nuk u prekën. Pak ose aspak toksicitet ndaj qelizave shtazore është një avantazh i derivateve të acidit ursonik nëse ato zhvillohen si herbicide për përdorim në fusha të hapura bujqësore. Në të vërtetë, meqenëse mikrotubulat janë struktura të zakonshme në eukariote, frenimi i tyre selektiv në bimë është një kërkesë kyçe për herbicidet. Për shembull, propizamidi, një agjent depolimerizues i mikrotubulave që lidhet drejtpërdrejt me tubulinën dhe pengon polimerizimin, përdoret si herbicid për shkak të toksicitetit të tij të ulët ndaj qelizave shtazore24. Në dallim nga disopiramidi, benzamidet e ngjashme kanë specifika të ndryshme të shënjestrës. Përveç mikrotubulave të bimëve, RH-4032 ose benzoksamidi gjithashtu pengon mikrotubulat e qelizave shtazore ose oomiceteve, përkatësisht, dhe zalilamidi përdoret si fungicid për shkak të fitotoksicitetit të tij të ulët25,26,27. Ariu i zbuluar rishtazi dhe derivatet e tij shfaqin citotoksicitet selektiv kundër bimëve, por vlen të përmendet se modifikimet e mëtejshme mund të ndryshojnë specifikën e tyre të shënjestrës, duke siguruar potencialisht derivate shtesë për kontrollin e kërpudhave patogjene ose oomiceteve.
Vetitë unike të acidit urbenonik dhe derivateve të tij janë të dobishme për zhvillimin e tyre si herbicide dhe për përdorimin si mjete kërkimore. Rëndësia e citoskeletit në kontrollin e formës së qelizave bimore njihet gjerësisht. Studimet e mëparshme kanë treguar se bimët kanë evoluar mekanizma kompleksë të organizimit të mikrotubulave kortikale duke kontrolluar dinamikën e mikrotubulave për të kontrolluar siç duhet morfogjenezën. Një numër i madh molekulash përgjegjëse për rregullimin e aktivitetit të mikrotubulave janë identifikuar dhe kërkimet përkatëse janë ende në vazhdim3,4,28. Kuptimi ynë aktual i dinamikës së mikrotubulave në qelizat bimore nuk i shpjegon plotësisht mekanizmat e organizimit të mikrotubulave kortikale. Për shembull, megjithëse si disopiramida ashtu edhe orizalina mund të depolimerizojnë mikrotubulat, disopiramida shkakton shtrembërim të rëndë të rrënjëve, ndërsa orizalina ka një efekt relativisht të butë. Për më tepër, mutacionet në tubulinë, e cila stabilizon mikrotubulat, shkaktojnë gjithashtu dekstrorotacion në rrënjë, ndërsa paklitakseli, i cili gjithashtu stabilizon dinamikën e mikrotubulave, nuk e bën. Prandaj, studimi dhe identifikimi i objektivave molekularë të acidit ursolik duhet të ofrojë njohuri të reja mbi rregullimin e mikrotubulave kortikale të bimëve. Po kështu, krahasimet e ardhshme të kimikateve që janë efektive në nxitjen e rritjes së shtrembëruar, siç është disopiramida, dhe kimikateve më pak efektive, siç janë orizalina ose acidi kumamotorik, do të japin të dhëna se si ndodh rritja e shtrembëruar.
Nga ana tjetër, rirregullimet citoskeletore të lidhura me mbrojtjen janë një tjetër mundësi për të shpjeguar citotoksicitetin e acidit ursonik. Infeksioni i një patogjeni ose futja e një nxitësi në qelizat bimore nganjëherë shkakton shkatërrimin e citoskeletit dhe vdekjen qelizore pasuese29. Për shembull, kriptoksantina e derivuar nga oomiceti është raportuar se prish mikrotubulat dhe filamentet e aktinës para vdekjes së qelizave të duhanit, ngjashëm me atë që ndodh me trajtimin KAND30,31. Ngjashmëritë midis përgjigjeve mbrojtëse dhe përgjigjeve qelizore të shkaktuara nga acidi ursonik na çuan të hipotetizojmë se ato shkaktojnë procese të zakonshme qelizore, megjithëse një efekt më i shpejtë dhe më i fortë i acidit ursonik sesa kriptoksantina është i dukshëm. Megjithatë, studimet kanë treguar se prishja e filamenteve të aktinës nxit vdekjen spontane të qelizave, e cila nuk shoqërohet gjithmonë me prishje të mikrotubulave29. Përveç kësaj, mbetet për t'u parë nëse patogjeni ose nxitësi shkakton rritje të shtrembëruar të rrënjëve, siç bëjnë derivatet e acidit ursonik. Kështu, njohuritë molekulare që lidhin përgjigjet mbrojtëse dhe citoskeletin janë një problem tërheqës që duhet adresuar. Duke shfrytëzuar praninë e komponimeve me peshë të ulët molekulare të lidhura me acidin ursonik, si dhe një gamë derivatesh me fuqi të ndryshme, ato mund të ofrojnë mundësi për të synuar mekanizma qelizorë të panjohur.
Të marra së bashku, zbulimi dhe zbatimi i komponimeve të reja që modulojnë dinamikën e mikrotubulave do të ofrojë metoda të fuqishme për të adresuar mekanizmat kompleksë molekularë që qëndrojnë në themel të përcaktimit të formës së qelizave bimore. Në këtë kontekst, komponimi i zhvilluar së fundmi, acidi urmotonik, i cili ndikon në mikrotubula dhe filamentet e aktinës dhe shkakton vdekjen e qelizave, mund të ofrojë një mundësi për të deshifruar lidhjen midis kontrollit të mikrotubulave dhe këtyre mekanizmave të tjerë. Kështu, analiza kimike dhe biologjike duke përdorur acidin urbenonik do të na ndihmojë të kuptojmë mekanizmat rregullues molekularë që kontrollojnë citoskeletin e bimëve.
Inokuloni S. werraensis MK493-CF1 në një balonë Erlenmeyer me diafragmë prej 500 mL që përmban 110 mL mjedis farash të përbërë nga 2% (w/v) galaktozë, 2% (w/v) pastë esenciale, 1% (w/v) përbërje Bacto. -soiton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) ekstrakt misri (KOGOSTCH Co., Ltd., Japoni), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 dhe 0.2% CaCO3 në ujë të deionizuar. (pH 7.4 para sterilizimit). Kulturat e farës u inkubuan në një tundës rrotullues (180 rpm) në 27°C për 2 ditë. Kultivimi i prodhimit nëpërmjet fermentimit në gjendje të ngurtë. Kultura e farës (7 ml) u transferua në një balonë K-1 500 ml që përmbante 40 g medium prodhimi të përbërë nga 15 g elb të shtypur (MUSO Co., Ltd., Japoni) dhe 25 g ujë të deionizuar (pH nuk është rregulluar para sterilizimit). Fermentimi u krye në 30°C në errësirë për 14 ditë. Materiali i fermentimit u nxor me 40 ml/shishe EtOH dhe u centrifugua (1500 g, 4°C, 10 min). Supernatanti i kulturës (60 ml) u nxor me një përzierje prej 10% MeOH/EtOAc. Shtresa organike u avullua nën presion të reduktuar për të përftuar një mbetje (59.5 mg), e cila iu nënshtrua HPLC me elucion gradient (0–10 minuta: 90%) në një kolonë me fazë të kundërt (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × gjatësi 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minuta: 90% H2O/CH3CN në 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minuta: 90% H2O/EtOH, 45–155 minuta: 90% H2O/EtOH në 100% EtOH (gradient (gradient), 155–200 min: 100% EtOH) me një shpejtësi rrjedhjeje prej 1.5 ml/min, kumamonamidi (1, 36.0 mg) u izolua si një pluhur amorf i bardhë.
Kumamotoamid(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ vlera e llogaritur: 141.0659, vlera e matur: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Farat e Kolumbias (Col-0) u morën nga Qendra e Burimeve Biologjike Arabidopsis (ABRC) me leje për përdorim kërkimor. Farat Col-0 u shumuan dhe u mirëmbajtën në kushtet tona laboratorike dhe u përdorën si bimë Arabidopsis të tipit të egër. Farat e Arabidopsis u sterilizuan sipërfaqësisht dhe u kultivuan në një mjedis gjysmë-konsistence Murashige dhe Skoog që përmbante 2% sukrozë (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (p/v) acid 2-(4-morfolino)etansulfonik (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ) dhe 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, në 23 °C dhe dritë konstante. Farat e mutantit phs1-1 u siguruan nga T. Hashimoto (Instituti i Shkencës dhe Teknologjisë Nara).
Farat e llojit SR-1 u siguruan nga T. Hashimoto (Instituti i Shkencës dhe Teknologjisë Nara) dhe u përdorën si bimë duhani të tipit të egër. Farat e duhanit u sterilizuan sipërfaqësisht dhe u zhytën në ujë steril për tre netë për të nxitur mbirjen, pastaj u vendosën në një tretësirë gjysmë-force që përmbante 2% sukrozë, 0.05% (p/v) MES dhe 0.8% gomë gellan (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. dhe Skoog medium) me pH 5.7 dhe u inkubuan në 23°C nën dritë konstante.
Shtami Tak-1 u sigurua nga T. Kohchi (Universiteti i Kiotos) dhe u përdor si njësia standarde eksperimentale për studimin e liverwort-it. Gemma u mor nga bimë të kultivuara të sterilizuara dhe më pas u vendos në një mjedis Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) që përmbante 1% sukrozë dhe 0.3% gomë gellani dhe u inkubua në 23°C nën dritë të vazhdueshme.
Qelizat e duhanit BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) u siguruan nga S. Hasezawa (Universiteti i Tokios). Qelizat BY-2 u holluan 95-fish në mjedis të modifikuar Linsmeier dhe Skoog dhe u plotësuan çdo javë me acid 2,4-diklorofenoksiacetik 32. Suspensioni qelizor u përzie në një tundës rrotullues në 130 rpm në 27°C në errësirë. Lani qelizat me 10 herë vëllimin e mjedisit të freskët dhe risuspendojini në të njëjtin mjedis. Linjat qelizore transgjenike BY-2 që shprehin në mënyrë të qëndrueshme shënuesin e mikrotubulave TagRFP-TUA6 ose shënuesin e filamentit të aktinës GFP-ABD2 nën promotorin e virusit mozaik të lulelakrës 35S u gjeneruan siç përshkruhet 33,34,35. Këto linja qelizore mund të mirëmbahen dhe sinkronizohen duke përdorur procedura të ngjashme me ato të përdorura për linjën qelizore origjinale BY-2.
Qelizat HeLa u kultivuan në mjedisin e modifikuar Dulbecco's Eagle's (DMEM) (Life Technologies) të plotësuar me 10% serum fetal të gjedhit, 1.2 U/ml penicilinë dhe 1.2 μg/ml streptomicinë në një inkubator 37°C me 5% CO2.
Të gjitha eksperimentet e përshkruara në këtë dorëshkrim u kryen në përputhje me rregulloret dhe udhëzimet japoneze të biosigurisë.
Komponimet u tretën në dimetil sulfoksid (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) si tretësira bazë dhe u holluan në medium MS për Arabidopsis dhe duhan ose në medium Gamborg B5 për mëlçi. Për analizën e frenimit të rritjes së rrënjëve, më shumë se 10 fara për pjatë u mbjellën në medium agari që përmbante komponimet e treguara ose DMSO. Farat u inkubuan në një dhomë rritjeje për 7 ditë. Fidanët u fotografuan dhe u mat gjatësia e rrënjëve. Për analizën e mbirjes së Arabidopsis, 48 fara për pjatë u mbjellën në medium agari që përmbante 200 μM përbërës ose DMSO. Farat e Arabidopsis u rritën në një dhomë rritjeje dhe numri i fidanëve të mbirë u numërua 7 ditë pas mbirjes (dag). Për analizën e mbirjes së duhanit, 24 fara për pjatë u mbjellën në medium agari që përmbante 200 μM KAND ose DMSO. Farat e duhanit u rritën në një dhomë rritjeje dhe numri i fidanëve të mbirë u numërua pas 14 ditësh. Për analizën e frenimit të rritjes së mëlçisë, 9 embrione nga secila pllakë u vendosën në një medium agari që përmbante përqendrimet e treguara të KAND ose DMSO dhe u inkubuan në një dhomë rritjeje për 14 ditë.
Përdorni fidanë të ngjyrosur me 5 mg/ml jodur propidiumi (PI) për të vizualizuar organizimin e meristemit të rrënjës. Sinjalet PI u vëzhguan me anë të mikroskopisë fluoreshente duke përdorur një mikroskop skanimi me lazer konfokal TCS SPE (Leica Microsystems).
Ngjyrosja histokimike e rrënjëve me β-glukuronidazë (GUS) u krye sipas protokollit të përshkruar nga Malami dhe Benfey36. Fidanët u fiksuan në aceton 90% gjatë natës, u ngjyrosën me 0.5 mg/ml acid 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-d-glukuronik në tampon GUS për 1 orë dhe u vendosën në një tretësirë kloraldehide të hidratuar (8 g hidrat kloral, 2 ml ujë dhe 1 ml glicerinë) dhe u vëzhguan me anë të mikroskopisë me kontrast diferencial interference duke përdorur një mikroskop Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Këndet e rrënjëve u matën në fidanë 7-ditorë të rritur në pjata të vendosura vertikalisht. Matni këndin e rrënjës nga drejtimi i vektorit të gravitetit siç përshkruhet në hapin 6.
Rregullimi i mikrotubulave kortikale u vu re siç përshkruhet, me modifikime të vogla në protokollin 37. Antitrupi anti-β-tubulinë (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) dhe anti-IgG i miut i konjuguar me Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) u përdorën si antitrupa primarë dhe sekondarë në hollime 1:1000 dhe 1:100, përkatësisht. Imazhet e fluoreshencës u morën duke përdorur një mikroskop skanimi me lazer konfokal TCS SPE (Leica Microsystems). Merrni imazhe Z-stack dhe krijoni projeksione me intensitet maksimal sipas udhëzimeve të prodhuesit.
Analiza e përhapjes së qelizave HeLa u krye duke përdorur Cell Counting Kit 8 (Dojindo) sipas udhëzimeve të prodhuesit.
Rritja e E. coli DH5α u analizua duke matur dendësinë qelizore në kulturë duke përdorur një spektrofotometër në 600 nm (OD600).
Organizimi citoskeletor në qelizat transgjenike BY-2 u vu re duke përdorur një mikroskop fluoreshent të pajisur me një pajisje skanimi konfokal CSU-X1 (Yokogawa) dhe një kamerë sCMOS (Zyla, Andor Technology). Dendësia citoskeletore u vlerësua me anë të analizës së imazhit, e cila përcaktoi përqindjen e pikselëve të citoskeletit midis pikselëve citoplazmatikë në imazhet konfokale duke përdorur softuerin ImageJ siç përshkruhet38,39.
Për të zbuluar vdekjen qelizore në qelizat BY-2, një alikot i suspensionit qelizor u inkubua me 0.05% blu Evans për 10 minuta në temperaturë ambienti. Ngjyrosja selektive me blu Evans e qelizave të ngordhura varet nga nxjerrja e ngjyrës nga qelizat e gjalla nga membrana plazmatike e paprekur40. Qelizat e ngjyrosura u vëzhguan duke përdorur një mikroskop me fushë të ndritshme (BX53, Olympus).
Qelizat HeLa u rritën në DMEM të plotësuar me 10% FBS në një inkubator të lagësht në 37°C dhe 5% CO2. Qelizat u trajtuan me 100 μM KAND 11, acid kumamonamike 6, kumamonamid 1, 100 ng/ml kolcemid (Gibco) ose 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) për 6 orë në 37°C. Qelizat u fiksuan me MetOH për 10 minuta dhe më pas me acetat për 5 minuta në temperaturë ambienti. Qelizat e fiksuara u inkubuan me antitrupin primar β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) të holluar në 0.5% BSA/PBS për 2 orë, u lanë 3 herë me TBST dhe më pas u inkubuan me antitrupin e dhisë Alexa Fluor. 488 1 orë. – IgG miu (Thermo Fisher Scientific: A11001) dhe 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) i holluar në 0.5% BSA/PBS. Pas larjes me TBST tri herë, qelizat e ngjyrosura u vunë re në një mikroskop të përmbysur Nikon Eclipse Ti-E. Imazhet u kapën me një kamerë CCD të ftohur Hamamatsu ORCA-R2 duke përdorur programin MetaMorph (Molecular Devices).
Koha e postimit: 17 qershor 2024