Faleminderit që vizituat Nature.com.Versioni i shfletuesit që po përdorni ka mbështetje të kufizuar CSS.Për rezultate më të mira, ju rekomandojmë të përdorni një version më të ri të shfletuesit tuaj (ose çaktivizoni modalitetin e përputhshmërisë në Internet Explorer).Ndërkohë, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne po e shfaqim sajtin pa stilim ose JavaScript.
Zbulimi dhe përdorimi i dobishëm i produkteve natyrore mund të ndihmojë në përmirësimin e jetës njerëzore.Kimikatet frenuese të rritjes së bimëve përdoren gjerësisht si herbicide për të kontrolluar barërat e këqija.Për shkak të nevojës për përdorimin e llojeve të ndryshme të herbicideve, lind nevoja për të identifikuar komponimet me mekanizma të rinj veprimi.Në këtë studim, ne zbuluam një përbërje të re N-alkoksipirrole, kumamonamid, nga Streptomyces werraensis MK493-CF1 dhe vendosëm procesin e plotë të sintezës.Nëpërmjet analizave të aktivitetit biologjik, ne zbuluam se urs-acidi monoamic është një ndërmjetës sintetik i urs-monoamidit dhe një potencialfrenues i rritjes së bimëve.Përveç kësaj, ne kemi zhvilluar derivate të ndryshëm të acidit urbenonik, duke përfshirë derivatin urbenyloxy (UDA), i cili ka aktivitet të lartë herbicid pa ndikuar negativisht në rritjen e qelizave HeLa.Ne zbuluam gjithashtu se derivatet e acidit urmotonik prishin mikrotubulat e bimëve;përveç kësaj, KAND ndikon në filamentet e aktinës dhe indukton vdekjen e qelizave;Këto efekte të shumëanshme ndryshojnë nga ato të frenuesve të njohur të mikrotubulave dhe sugjerojnë një mekanizëm të ri veprimi për acidin ursonik, i cili përfaqëson një avantazh të rëndësishëm në zhvillimin e herbicideve të reja.
Zbulimi dhe zbatimi praktik i produkteve natyrore të dobishme dhe derivateve të tyre është një mjet për të përmirësuar cilësinë e jetës njerëzore.Metabolitët dytësorë të prodhuar nga mikroorganizmat, bimët dhe insektet kanë çuar në përparime të mëdha në mjekësi dhe bujqësi.Shumë antibiotikë dhe ilaçe kundër leuçemisë janë zhvilluar nga produkte natyrale.Përveç kësaj, lloje të ndryshme tëpesticideve, fungicidet dhe herbicidet nxirren nga këto produkte natyrore për përdorim në bujqësi.Në veçanti, herbicidet për kontrollin e barërave të këqija janë mjete të rëndësishme për rritjen e rendimenteve të të korrave në bujqësinë moderne, dhe lloje të ndryshme të përbërjeve përdoren tashmë në treg.Disa procese qelizore në bimë, të tilla si fotosinteza, metabolizmi i aminoacideve, sinteza e murit qelizor, rregullimi i mitozës, sinjalizimi i fitohormoneve ose sinteza e proteinave, konsiderohen si objektiva tipikë të herbicideve.Komponimet që pengojnë funksionin e mikrotubulave janë një klasë e zakonshme herbicidesh që ndikojnë në rritjen e bimëve duke ndikuar në rregullimin mitotik2.
Mikrotubulat janë përbërës të citoskeletit dhe ruhen gjerësisht në qelizat eukariote.Heterodimeri i tubulinës përbëhet nga α-tubulina dhe β-tubulina që formojnë protofilamente lineare të mikrotubulave, me 13 protofilamente që formojnë një strukturë cilindrike.Mikrotubulat luajnë role të shumëfishta në qelizat bimore, duke përfshirë përcaktimin e formës së qelizave, ndarjen e qelizave dhe transportin ndërqelizor3,4.Qelizat bimore përmbajnë mikrotubula nën membranën plazmatike ndërfazore dhe këto të ashtuquajtura mikrotubula kortikale mendohet se kontrollojnë organizimin e mikrofibrileve të celulozës nëpërmjet rregullimit të komplekseve të sintazës së celulozës4,5.Mikrotubulat kortikale të qelizave epidermale të rrënjës, të pranishme në zonën e zgjatjes së shpejtë të majës së rrënjës, janë të vendosura anash, dhe mikrofibrat celuloze ndjekin këto mikrotubula dhe kufizojnë drejtimin e zgjerimit të qelizave, duke nxitur kështu zgjatjen anizotropike të qelizave.Prandaj, funksioni i mikrotubulave është i lidhur ngushtë me morfologjinë e bimëve.Zëvendësimet e aminoacideve në gjenet që kodojnë tubulinën shkaktojnë shtrembërim të vargjeve të mikrotubulave kortikale dhe rritje në anën e majtë ose të djathtë në Arabidopsis 6,7.Në mënyrë të ngjashme, mutacionet në proteinat e lidhura me mikrotubulat që rregullojnë dinamikën e mikrotubulave mund të çojnë gjithashtu në rritje të shtrembëruar të rrënjëve8,9,10,11,12,13.Për më tepër, trajtimi me herbicide që prishin mikrotubulat si disopiramidi, i njohur gjithashtu si pretilaklor, gjithashtu shkakton rritjen e zhdrejtë të rrënjës në anën e majtë14.Këto të dhëna tregojnë se rregullimi i saktë i funksionit të mikrotubulave është kritik për përcaktimin e drejtimit të rritjes së bimëve.
Janë zbuluar lloje të ndryshme të frenuesve të mikrotubulave dhe këto barna kanë dhënë një kontribut të rëndësishëm në kërkimin citoskeletor, si dhe në bujqësi dhe mjekësi2.Në veçanti, oryzalin, komponimet dinitroaniline, disopiramidi, komponimet e lidhura me benzamidin dhe analogët e tyre mund të pengojnë funksionin e mikrotubulave dhe në këtë mënyrë të pengojnë rritjen e bimëve.Prandaj, ato përdoren gjerësisht si herbicide.Megjithatë, meqenëse mikrotubulat janë një komponent i rëndësishëm i qelizave bimore dhe shtazore, shumica e frenuesve të mikrotubulave janë citotoksikë për të dy llojet e qelizave.Prandaj, pavarësisht nga dobia e tyre e njohur si herbicide, një numër i kufizuar agjentësh antimikrotubulorë përdoren për qëllime praktike.
Streptomyces është një gjini e familjes Streptomyces, e cila përfshin baktere aerobe, gram-pozitive, filamentoze dhe është e njohur gjerësisht për aftësinë e saj për të prodhuar një gamë të gjerë metabolitësh dytësorë.Prandaj, konsiderohet si një nga burimet më të rëndësishme të produkteve të reja natyrore biologjikisht aktive.Në studimin aktual, ne zbuluam një përbërës të ri të quajtur kumamonamid, i cili u izolua nga Streptomyces werraensis MK493-CF1 dhe S. werraensis ISP 5486. Duke përdorur analizën spektrale dhe analizën e plotë spektrale, u karakterizua struktura e kumamonamidit dhe skeli i tij unik N-alkoksipirrole u përcaktua.sintezë.Acidi ursmonik, një ndërmjetës sintetik i ursmonoamidit dhe derivateve të tij, u zbulua se pengon rritjen dhe mbirjen e bimës model popullor Arabidopsis thaliana.Në një studim të marrëdhënies strukturë-aktivitet, ne zbuluam se një përbërës me C9 i modifikuar në acid ursonik, i quajtur derivat joiloksi i acidit ursonik (KAND), rrit ndjeshëm efektin frenues në rritje dhe mbirje.Veçanërisht, frenuesi i rritjes së bimëve të sapo zbuluar ndikoi gjithashtu në rritjen e duhanit dhe mëlçisë dhe nuk ishte citotoksik për bakteret ose qelizat HeLa.Për më tepër, disa derivate të acidit urmotonik shkaktojnë një fenotip të shtrembëruar të rrënjës, duke nënkuptuar se këto derivate ndikojnë drejtpërdrejt ose indirekt në mikrotubulat.Në përputhje me këtë ide, vëzhgimet tona të mikrotubulave të etiketuara ose imunohistokimikisht ose me proteina fluoreshente tregojnë se trajtimi KAND depolimerizon mikrotubulat.Përveç kësaj, trajtimi me derivate të acidit kumamotonik prishi mikrofilamentet e aktinës.Kështu, ne kemi zbuluar një frenues të ri të rritjes së bimëve, mekanizmi unik i veprimit të të cilit përfshin shkatërrimin e citoskeletit.
Lloji MK493-CF1 u izolua nga toka në Shinagawa-ku, Tokio.Sfida MK493-CF1 formoi miceli stromal të degëzuar mirë.U përcaktua sekuenca e pjesshme e gjenit ARN ribozomale 16S (1422 bp).Ky shtam është shumë i ngjashëm me S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tendosje tipike, 99.93%).Në bazë të këtij rezultati, u konstatua se ky lloj ishte i lidhur ngushtë me shtamin e tipit të S. werraensis.Prandaj, ne e emërtuam përkohësisht këtë lloj S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T gjithashtu prodhon të njëjtat komponime bioaktive.Meqenëse kishte pak kërkime të hershme për marrjen e produkteve natyrale nga ky mikroorganizëm, u kryen kërkime të mëtejshme kimike.Pas kultivimit të S. werraensis MK493-CF1 në mjedis elbi me fermentim në gjendje të ngurtë në 30°C për 14 ditë, mjedisi u nxor me 50% EtOH.60 ml kampion u tha për të marrë 59.5 mg ekstrakt të papërpunuar.Ekstrakti i papërpunuar iu nënshtrua HPLC me fazë të kundërt për të dhënë N-metoksi-1H-pirrol-2-karboksamid (1, i quajtur kumamonamid, 36.0 mg).Sasia totale e 1 është afërsisht 60% e ekstraktit të papërpunuar.Prandaj, vendosëm të studiojmë në detaje vetitë e kumamotoamidit 1.
Kumamonamidi 1 është një pluhur amorf i bardhë dhe spektrometria e masës me rezolucion të lartë (HRESIMS) konfirmon C6H8N2O2 (Fig. 1).Fragmenti i pirrolit të zëvendësuar me C2 i këtij përbërësi karakterizohet nga δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH në spektrin 1H NMR: 4.5 Hz , H-5) dhe δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), dhe spektri 13C NMR tregon praninë e katër atomeve të karbonit sp2.Prania e një grupi amide në pozicionin C2 u vlerësua nga korrelacioni HMBC nga protoni C-3 në karbonin amid karbonil në δC 161.1.Për më tepër, majat 1H dhe 13 C NMR në δH 4.10 (3H, S) dhe δC 68.3 tregojnë praninë e grupeve N-metoksi në molekulë.Megjithëse pozicioni i saktë i grupit metoksi nuk ishte përcaktuar ende duke përdorur analizën spektroskopike si spektroskopia e diferencës së zgjeruar dhe shkurtesa bërthamore Overhauser (NOEDF), N-metoksi-1H-pirrole-2-karboksamidi u bë përbërësi i parë kandidat.
Për të përcaktuar strukturën e saktë të 1, u krye një sintezë totale (Fig. 2a).Trajtimi i 2-aminopiridinës 2 të disponueshme në treg me m-CPBA rezultoi në rendimentin sasior të N-oksidit 3 përkatës.Pas 2-aminoazidimit të 2, reaksioni i ciklokondensimit i përshkruar nga Abramovich u krye në benzen në 90°C për të marrë 1-hidroksi-1H-pirrol-2-karbonitrilin e dëshiruar 5 në gram.Shpejtësia 60% (dy faza).15,16.Metilimi dhe hidroliza e 4 më pas dhanë acid 1-metoksi-1H-pirrole-2-karboksilik (i quajtur "acid kumotonik", 6) me rendiment të mirë (70%, dy hapa).Së fundi, amidimi nëpërmjet ndërmjetësit të klorurit acid 6 duke përdorur amoniak ujor dha Kumamoto amide 1 në rendiment 98%.Të gjitha të dhënat spektrale të 1 të sintetizuar ishin të ngjashme me 1 të izoluar, kështu që u përcaktua struktura e 1;
Sinteza e përgjithshme dhe analiza e aktivitetit biologjik të urbenamidit dhe acidit urbenik.(a) Sinteza totale e amidit Kumamoto.(b) Fidanët Arabidopsis Columbia (Col) të tipit të egër shtatëditorë u rritën në pllaka Murashige dhe Skoog (MS) që përmbajnë kumamonamid 6 ose kumamonamid 1 në përqendrimet e treguara.Shiriti i shkallës = 1 cm.
Së pari, ne vlerësuam aktivitetet biologjike të urbenamidit dhe ndërmjetësve të tij për aftësinë e tyre për të moduluar rritjen e bimëve.Ne shtuam përqendrime të ndryshme të ursmonamidit 1 ose acidit ursmonik 6 në mjedisin MS agar dhe kultivuam fidane Arabidopsis thaliana në këtë mjedis.Këto analiza treguan se përqendrimet e larta (500 μM) të 6 frenuan rritjen e rrënjëve (Fig. 2b).Më pas, ne krijuam derivate të ndryshëm duke zëvendësuar pozicionin N1 të 6 dhe kryem studime të marrëdhënieve strukturë-aktivitet mbi to (procesi i sintezës analoge përshkruhet në Informacionin Mbështetës (SI)).Fidanët Arabidopsis u rritën në një mjedis që përmban 50 μM derivate të acidit ursonik dhe u mat gjatësia e rrënjës.siç tregohet në foto.Siç tregohet në figurat 3a, b dhe S1, acidet kumamo kanë gjatësi të ndryshme zinxhirësh alkoksi linearë (9, 10, 11, 12 dhe 13) ose zinxhirë të mëdhenj alkoksi (15, 16 dhe 17) në pozicionin N1.Derivatet treguan frenim të konsiderueshëm të rritjes së rrënjëve.Përveç kësaj, ne zbuluam se aplikimi i 200 μM 10, 11, ose 17 pengoi mbirjen (Fig. 3c dhe S2).
Studimi i marrëdhënies strukturë-aktivitet të amidit Kumamoto dhe komponimeve të lidhura me to.(a) Struktura dhe skema e sintezës së analogëve.(b) Përcaktimi sasior i gjatësisë së rrënjëve të fidanëve 7-ditorë të rritur në mjedis MS me ose pa derivate kumamonamide 50 μM.Yjet tregojnë dallime të rëndësishme me trajtimin e rremë (testi t, f< 0.05).n>18. Të dhënat tregohen si mesatare ± SD.nt do të thotë "i pa testuar" sepse më shumë se 50% e farave nuk mbijnë.(c) Përcaktimi sasior i shkallës së mbirjes së farave të trajtuara të inkubuara për 7 ditë në mjedis MS me ose pa 200 μM kumamonamid dhe përbërës të ngjashëm.Yjet tregojnë dallime të rëndësishme me trajtimin e rremë (testi chi-square).n=96.
Është interesante se shtimi i zinxhirëve anësor alkil më të gjatë se C9 reduktoi aktivitetin frenues, duke sugjeruar që komponimet e lidhura me acidin kumamotoik kërkojnë zinxhirë anësor të një madhësie të caktuar për të shfaqur aktivitetin e tyre biologjik.
Për shkak se analiza e marrëdhënies strukturë-aktivitet tregoi se C9 ishte modifikuar në acid ursonik dhe derivati joiloksi i acidit ursonik (në vijim referuar si KAND 11) ishte frenuesi më efektiv i rritjes së bimëve, ne kryem një karakterizim më të detajuar të KAND 11. Trajtimi i Arabidopsis me 50 μM KAND 11 pothuajse plotësisht parandaloi mbirjen, ndërsa përqendrimet më të ulëta (40, 30, 20 ose 10 μM) të KAND 11 penguan rritjen e rrënjëve në një mënyrë të varur nga doza (Fig. 4a, b).Për të testuar nëse KAND 11 ndikon në qëndrueshmërinë e meristemit të rrënjës, ne ekzaminuam meristemet e rrënjëve të ngjyrosura me jodur propidium (PI) dhe matëm madhësinë e sipërfaqes së meristemit.Madhësia e meristemit të fidanëve të rritur në një mjedis që përmban 25 μM KAND-11 ishte 151,1 ± 32,5 μm, ndërsa madhësia e meristemit të fidanëve të rritur në një mjedis kontrolli që përmban DMSO ishte 264,7 ± 30,8 μm (Fig. 4c, d) , që tregon se KAND-11 rikthen aktivitetin qelizor.duke u përhapur.Meristemi i rrënjës.Në përputhje me këtë, trajtimi KAND 11 zvogëloi sasinë e sinjalit të shënuesit të ndarjes qelizore CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS në meristemin e rrënjës (Fig. 4e) 17 .Këto rezultate tregojnë se KAND 11 pengon rritjen e rrënjëve duke reduktuar aktivitetin e proliferimit të qelizave.
Analiza e efektit frenues të derivateve të acidit urbenik (derivatet urbeniloksi) në rritje.(a) Fidanët Col 7-ditorë të tipit të egër të rritur në pllaka MS me përqendrimet e treguara të KAND 11. Shiriti i shkallës = 1 cm.(b) Kuantifikimi i gjatësisë së rrënjës.Shkronjat tregojnë dallime të rëndësishme (Tukey HSD test, f< 0.05).n>16. Të dhënat tregohen si mesatare ± SD.(c) Mikroskopi konfokal i rrënjëve Col të tipit të egër të ngjyrosura me jodur propidium të rritura në pllaka MS me ose pa 25 μM KAND 11. Kllapat e bardha tregojnë meristemin e rrënjës.Shiriti i shkallës = 100 µm.(d) Kuantifikimi i madhësisë së meristemit të rrënjës (n = 10 deri në 11).Ndryshimet statistikore u përcaktuan duke përdorur T-test (f< 0.05).Shiritat përfaqësojnë madhësinë mesatare të meristemit.(e) Mikroskopi me kontrast me ndërhyrje diferenciale (DIC) të një meristemi rrënjësor që përmban konstruktin CDKB2;1pro: CDKB2;1-GUS u ngjyros dhe u ngjyros në fidanë 5-ditorë të rritur në pllaka MS me ose pa analizën KAND 25 μM.
Fitotoksiciteti i KAND 11 u testua më tej duke përdorur një bimë tjetër dykotiledone, duhanin (Nicotiana tabacum) dhe një organizëm të modelit kryesor të bimëve tokësore, liverwort (Marchantia polymorpha).Ashtu si në rastin e Arabidopsis, fidanët e duhanit SR-1 të rritur në mjedis që përmban 25 μM KAND 11 prodhuan rrënjë më të shkurtra (Fig. 5a).Për më tepër, 40 nga 48 farat mbinë në pjata që përmbajnë 200 μM KAND 11, ndërsa të 48 farat mbinë në mjedise të trajtuara si model, duke treguar se përqendrimet më të larta të KAND ishin domethënëse (p< 0,05;testi chi -katror) pengoi mbirjen e duhanit.(Fig. 5b).Përveç kësaj, përqendrimi i KAND 11 që pengoi rritjen bakteriale në mëlçinë ishte i ngjashëm me përqendrimin efektiv në Arabidopsis (Fig. 5c).Këto rezultate tregojnë se KAND 11 mund të pengojë rritjen e një shumëllojshmërie bimësh.Më pas hetuam citotoksicitetin e mundshëm të komponimeve të lidhura me monoamidin e ariut në organizma të tjerë, përkatësisht qelizat HeLa njerëzore dhe shtamin Escherichia coli DH5α, si përfaqësues të qelizave më të larta të kafshëve dhe baktereve, përkatësisht.Në një seri analizash të përhapjes së qelizave, ne vumë re se kumamonamidi 1, acidi kumamonamidik 6 dhe KAND 11 nuk ndikuan në rritjen e qelizave HeLa ose E. coli në përqendrime prej 100 μM (Fig. 5d, e).
Frenimi i rritjes së KAND 11 në organizmat jo-arabidopsis.(a) Fidanët e duhanit SR-1 të tipit të egër dy-javor u rritën në pllaka MS të pozicionuara vertikalisht që përmbanin 25 μM KAND 11. (b) Fidanët e duhanit të tipit të egër SR-1 dy javësh u rritën në pozicione horizontale Pllakat MS që përmbajnë 200 μM KAND 11. (c) Sythat e mëlçisë Tak-1 të tipit të egër dyjavor të rritur në pllaka Gamborg B5 me përqendrimin e treguar të KAND 11. Shigjetat e kuqe tregojnë sporet që ndaluan së rrituri brenda inkubacionit dy-javor periudhë.(d) Analiza e proliferimit qelizor të qelizave HeLa.Numri i qelizave të qëndrueshme u mat në intervale kohore fikse duke përdorur një komplet të numërimit të qelizave 8 (Dojindo).Si kontroll, qelizat HeLa u trajtuan me 5 μg/ml aktinomycin D (Act D), e cila pengon transkriptimin e ARN polimerazës dhe shkakton vdekjen e qelizave.Analizat u kryen në tre kopje.(e) analiza e proliferimit të qelizave E. coli.Rritja e E. coli u analizua duke matur OD600.Si kontroll, qelizat u trajtuan me 50 μg/ml ampicilinë (Amp), e cila pengon sintezën e murit qelizor bakterial.Analizat u kryen në tre kopje.
Për të deshifruar mekanizmin e veprimit të citotoksicitetit të shkaktuar nga komponimet e lidhura me uramidin, ne rianalizuam derivatet e acidit urbenik me efekte të moderuara frenuese.siç tregohet në foto.Siç tregohet në figurat 2b, 6a, fidanët e rritur në pllaka agari që përmbajnë përqendrime të larta (200 μM) të acidit urmotonik 6 prodhuan rrënjë më të shkurtra dhe të lakuar majtas (θ = – 23,7 ± 6,1), ndërsa nga fidanët e rritur në mjedisin e kontrollit, fidanët prodhonin rrënjë pothuajse të drejta (θ = – 3,8 ± 7,1).Kjo rritje karakteristike e zhdrejtë dihet se rezulton nga mosfunksionimi i mikrotubulave kortikale14,18.Në përputhje me këtë gjetje, medikamentet destabilizuese të mikrotubulave disopiramide dhe oryzalin shkaktuan anim të ngjashëm të rrënjëve në kushtet tona të rritjes (Fig. 2b, 6a).Në të njëjtën kohë, ne testuam derivatet e acidit urmotonik dhe zgjodhëm disa prej tyre që, në përqendrime të caktuara, nxitën rritjen e zhdrejtë të rrënjës.Përbërjet 8, 9 dhe 15 ndryshuan drejtimin e rritjes së rrënjëve në 75 μM, 50 μM dhe 40 μM, përkatësisht, duke treguar se këto komponime mund të destabilizojnë në mënyrë efektive mikrotubulat (Fig. 2b, 6a).Ne testuam gjithashtu derivatin më të fuqishëm të acidit ursolik, KAND 11, në një përqendrim më të ulët (15 μM) dhe zbuluam se aplikimi i KAND 11 frenonte rritjen e rrënjëve dhe se drejtimi i rritjes së rrënjëve ishte i pabarabartë, megjithëse ato prireshin të pjerrnin në të majtë ( Figura C3)..Për shkak se përqendrimet më të larta të barnave destabilizuese të mikrotubulave ndonjëherë pengojnë rritjen e bimëve në vend që të shkaktojnë animin e rrënjëve, ne vlerësuam më pas mundësinë që KAND 11 të ndikojë në mikrotubulat duke vëzhguar mikrotubulat kortikale në qelizat epidermale të rrënjës.Imunohistokimia duke përdorur antitrupa anti-β-tubulinë në qelizat epidermale të rrënjëve të fidanëve të trajtuara me 25 μM KAND 11 tregoi zhdukjen e pothuajse të gjithë mikrotubulave kortikale në qelizat epidermale në zonën e zgjatjes (Fig. 6b).Këto rezultate tregojnë se acidi kumamotonik dhe derivatet e tij veprojnë drejtpërdrejt ose indirekt në mikrotubulat për t'i prishur ato dhe se këto komponime janë frenues të rinj të mikrotubulave.
Acidi ursonik dhe derivatet e tij ndryshojnë mikrotubulat kortikale në Arabidopsis thaliana.(a) Këndi i prirjes së rrënjës i matur në prani të derivateve të ndryshëm të acidit urmotonik në përqendrimet e treguara.Efektet e dy komponimeve të njohura për frenimin e mikrotubulave: disopiramidi dhe oryzalina u analizuan gjithashtu.Pjesa e brendshme tregon standardin e përdorur për të matur këndin e rritjes së rrënjës.Yjet tregojnë dallime të rëndësishme me trajtimin e rremë (testi t, f< 0.05).n>19. Shiriti i shkallës = 1 cm.(b) Mikrotubulat kortikale në qelizat epidermale në zonën e zgjatjes.Mikrotubulat në rrënjët Arabidopsis Col të tipit të egër të rritura në pllaka MS me ose pa 25 μM KAND 11 u vizualizuan me ngjyrosje imunohistokimike duke përdorur antitrupa primar β-tubulin dhe antitrupa sekondarë të konjuguar me Alexa Fluor.Shiriti i shkallës = 10 µm.(c) Struktura mitotike e mikrotubulave në meristemin e rrënjës.Mikrotubulat u vizualizuan duke përdorur ngjyrosje imunohistokimike.Strukturat mitotike, duke përfshirë zonat profazë, boshtet dhe fragmoplastet, u numëruan nga imazhet konfokale.Shigjetat tregojnë strukturat e mikrotubulave mitotike.Yjet tregojnë dallime të rëndësishme me trajtimin e rremë (testi t, f< 0.05).n>9. Shiriti i shkallës = 50 µm.
Megjithëse Ursa ka aftësinë të prishë funksionin e mikrotubulave, mekanizmi i veprimit të tij pritet të jetë i ndryshëm nga agjentët tipikë depolimerizues të mikrotubulave.Për shembull, përqendrimet më të larta të agjentëve depolimerizues të mikrotubulave si disopiramidi dhe orizalina nxisin zgjerimin anizotropik të qelizave epidermale, ndërsa KAND 11 jo.Përveç kësaj, bashkë-aplikimi i KAND 11 dhe disopiramidi rezultoi në një reagim të kombinuar të rritjes së rrënjëve të nxitur nga disopiramidi dhe u vu re frenimi i rritjes i shkaktuar nga KAND 11 (Fig. S4).Ne analizuam gjithashtu përgjigjen e mutantit disopiramid 1-1 (phs1-1) tepër të ndjeshëm ndaj KAND 11. phs1-1 ka një mutacion jo-kanonik në pikën e tubulin kinazës dhe prodhon rrënjë më të shkurtra kur trajtohet me disopiramid9,20.Fidanët mutantë phs1-1 të rritur në mjedis agar që përmban KAND 11 kishin rrënjë më të shkurtra të ngjashme me ato të rritura në disopiramidë (fig. S5).
Përveç kësaj, ne vëzhguam strukturat mitotike të mikrotubulave, si zonat profazë, boshtet dhe fragmoplastet, në meristemin rrënjësor të fidanëve të trajtuar me KAND 11. Në përputhje me vëzhgimet për CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, një rënie e ndjeshme në u vu re numri i mikrotubulave mitotike (Fig. .6c).
Për të karakterizuar citotoksicitetin e KAND 11 në rezolucionin nënqelizor, ne trajtuam qelizat e suspensionit BY-2 të duhanit me KAND 11 dhe vëzhguam përgjigjen e tyre.Fillimisht shtuam KAND 11 në qelizat BY-2 që shprehin TagRFP-TUA6, i cili etiketon në mënyrë fluoreshente mikrotubulat, për të vlerësuar efektin e KAND 11 në mikrotubulat kortikale.Dendësia e mikrotubulave kortikale u vlerësua duke përdorur analizën e imazhit, e cila përcaktoi përqindjen e pikselëve citoskeletor midis pikselëve citoplazmikë.Rezultatet e analizës treguan se pas trajtimit me 50 μM ose 100 μM KAND 11 për 1 orë, dendësia u ul ndjeshëm në 0,94 ± 0,74% ose 0,23 ± 0,28%, respektivisht, ndërsa dendësia e qelizave të trajtuara me DMSO , arriti në 1,631 ± % (Fig. 7a).Këto rezultate janë në përputhje me vëzhgimin në Arabidopsis se trajtimi KAND 11 shkakton depolimerizimin e mikrotubulave kortikale (Fig. 6b).Ne ekzaminuam gjithashtu linjën BY-2 me filamente të aktinës të etiketuara GFP-ABD pas trajtimit me të njëjtin përqendrim të KAND 11 dhe vumë re se trajtimi KAND 11 prishi fijet e aktinës.Trajtimi me 50 μM ose 100 μM KAND 11 për 1 orë uli ndjeshëm densitetin e filamentit të aktinës në 1,20 ± 0,62% ose 0,61 ± 0,26%, përkatësisht, ndërsa dendësia në qelizat e trajtuara me DMSO ishte 1,69 ± 0,52% (Fig 0,52%).7b).Këto rezultate janë në kontrast me efektet e propizamidit, i cili nuk ndikon në filamentet e aktinës, dhe latrunculin B, një depolimerues i aktinës që nuk ndikon në mikrotubulat (SI Figura S6).Përveç kësaj, trajtimi me kumamonamid 1, acid kumamonamid 6 ose KAND 11 nuk ndikoi mikrotubulat në qelizat HeLa (SI Figura S7).Kështu, mekanizmi i veprimit të KAND 11 besohet të jetë i ndryshëm nga ai i ndërprerësve të njohur të citoskeletit.Përveç kësaj, vëzhgimi ynë mikroskopik i qelizave BY-2 të trajtuara me KAND 11 zbuloi fillimin e vdekjes qelizore gjatë trajtimit KAND 11 dhe tregoi se përqindja e qelizave të vdekura të ngjyrosura me blu Evans nuk u rrit ndjeshëm pas 30 minutash të trajtimit KAND 11, ndërsa pas 90 minutash trajtim me 50 μM ose 100 μM KAND, numri i qelizave të vdekura u rrit përkatësisht në 43,7% ose 80,1% (Fig. 7c).Të marra së bashku, këto të dhëna tregojnë se derivati i ri i acidit ursolik KAND 11 është një frenues citoskeletor specifik për bimët me një mekanizëm veprimi të panjohur më parë.
KAND ndikon në mikrotubulat kortikale, filamentet e aktinës dhe qëndrueshmërinë e qelizave BY-2 të duhanit.(a) Vizualizimi i mikrotubulave kortikale në qelizat BY-2 në prani të TagRFP-TUA6.Qelizat BY-2 të trajtuara me KAND 11 (50 μM ose 100 μM) ose DMSO u ekzaminuan me mikroskop konfokal.Dendësia e mikrotubulave kortikale u llogarit nga mikrografitë e 25 qelizave të pavarura.Shkronjat tregojnë dallime të rëndësishme (Tukey HSD test, f< 0.05).Shiriti i shkallës = 10 µm.(b) Filamentet kortikale të aktinës në qelizat BY-2 të vizualizuara në prani të GFP-ABD2.Qelizat BY-2 të trajtuara me KAND 11 (50 μM ose 100 μM) ose DMSO u ekzaminuan me mikroskop konfokal.Dendësia e filamenteve të aktinës kortikale u llogarit nga mikrografët e 25 qelizave të pavarura.Shkronjat tregojnë dallime të rëndësishme (Tukey HSD test, f< 0.05).Shiriti i shkallës = 10 µm.(c) Vëzhgimi i qelizave të vdekura BY-2 nga ngjyrosja blu Evans.Qelizat BY-2 të trajtuara me KAND 11 (50 μM ose 100 μM) ose DMSO u ekzaminuan me mikroskop me fushë të ndritshme.n=3.Shiriti i shkallës = 100 µm.
Zbulimi dhe aplikimi i produkteve të reja natyrore ka çuar në përparime të rëndësishme në aspekte të ndryshme të jetës njerëzore, duke përfshirë mjekësinë dhe bujqësinë.Hulumtime historike janë kryer për të marrë komponime të dobishme nga burimet natyrore.Në veçanti, aktinomicetet njihen si të dobishme si antibiotikë antiparazitarë për nematodat për shkak të aftësisë së tyre për të prodhuar metabolitë të ndryshëm dytësorë si avermectin, përbërësi i plumbit i ivermectin dhe bleomycin dhe derivatet e saj, të përdorura në mjekësi si një agjent antikancerogjen21,22.Po kështu, nga aktinomicetet janë zbuluar një sërë përbërjesh herbicidale, disa prej të cilave tashmë përdoren në treg1,23.Prandaj, analiza e metabolitëve të aktinomiceteve për të izoluar produktet natyrore me aktivitetet e dëshiruara biologjike konsiderohet një strategji efektive.Në këtë studim, ne zbuluam një përbërës të ri, kumamonamid, nga S. werraensis dhe e sintetizuam me sukses atë.Acidi ursonik është një ndërmjetës sintetik i urbenamidit dhe derivateve të tij.Mund të shkaktojë kaçurrela karakteristike të rrënjëve, të shfaqë aktivitet herbicid të moderuar deri në të fortë dhe të dëmtojë drejtpërdrejt ose tërthorazi mikrotubulat e bimëve.Megjithatë, mekanizmi i veprimit të acidit urmotonik mund të ndryshojë nga ai i frenuesve ekzistues të mikrotubulave, pasi KAND 11 gjithashtu prish filamentet e aktinës dhe shkakton vdekjen qelizore, duke sugjeruar një mekanizëm rregullues me të cilin acidi urmotonik dhe derivatet e tij ndikojnë në një gamë të gjerë strukturash citoskeletore..
Karakterizimi i mëtejshëm i detajuar i acidit urbenik do të ndihmojë për të kuptuar më mirë mekanizmin e veprimit të acidit urbenik.Në veçanti, qëllimi tjetër është të vlerësohet aftësia e acidit ursonik për t'u lidhur me mikrotubulat e reduktuar për të përcaktuar nëse acidi ursonik dhe derivatet e tij veprojnë drejtpërdrejt në mikrotubulat dhe i depolimerizojnë ato, ose nëse veprimi i tyre rezulton në destabilizimin e mikrotubulave.Përveç kësaj, në rastin kur mikrotubulat nuk janë një objektiv i drejtpërdrejtë, identifikimi i vendit të veprimit dhe objektivave molekularë të acidit ursonik në qelizat bimore do të ndihmojë në kuptimin e mëtejshëm të vetive të përbërjeve të lidhura me to dhe mënyrave të mundshme për të përmirësuar aktivitetin herbicid.Analiza jonë e bioaktivitetit zbuloi aftësinë unike citotoksike të acidit ursonik në rritjen e bimëve si Arabidopsis thaliana, duhani dhe liverwort, ndërkohë që as qelizat E. coli dhe HeLa nuk u prekën.Pak ose aspak toksicitet ndaj qelizave shtazore është një avantazh i derivateve të acidit ursonik nëse ato zhvillohen si herbicide për përdorim në fusha të hapura bujqësore.Në të vërtetë, meqenëse mikrotubulat janë struktura të zakonshme tek eukariotët, frenimi i tyre selektiv në bimë është një kërkesë kryesore për herbicidet.Për shembull, propyzamidi, një agjent depolimerues i mikrotubulave që lidhet drejtpërdrejt me tubulinën dhe frenon polimerizimin, përdoret si herbicid për shkak të toksicitetit të tij të ulët ndaj qelizave shtazore24.Në kontrast me disopiramidin, benzamidet e lidhura kanë specifika të ndryshme të objektivit.Përveç mikrotubulave të bimëve, RH-4032 ose benzoxamidi gjithashtu frenon përkatësisht mikrotubulat e qelizave shtazore ose omicetet dhe zalilamide përdoret si fungicid për shkak të fitotoksicitetit të tij të ulët25,26,27.Ariu i sapo zbuluar dhe derivatet e tij shfaqin citotoksicitet selektiv ndaj bimëve, por vlen të përmendet se modifikimet e mëtejshme mund të ndryshojnë specifikën e tyre të synuar, duke siguruar potencialisht derivate shtesë për kontrollin e kërpudhave patogjene ose oomycetes.
Vetitë unike të acidit urbenonik dhe derivateve të tij janë të dobishme për zhvillimin e tyre si herbicide dhe përdorimin si mjete kërkimore.Rëndësia e citoskeletit në kontrollin e formës së qelizave bimore njihet gjerësisht.Studimet e mëparshme kanë treguar se bimët kanë evoluar mekanizma komplekse të organizimit të mikrotubulave kortikale duke kontrolluar dinamikën e mikrotubulave për të kontrolluar siç duhet morfogjenezën.Janë identifikuar një numër i madh i molekulave përgjegjëse për rregullimin e aktivitetit të mikrotubulave, dhe kërkimet e lidhura janë ende në vazhdim3,4,28.Kuptimi ynë aktual i dinamikës së mikrotubulave në qelizat bimore nuk shpjegon plotësisht mekanizmat e organizimit të mikrotubulave kortikale.Për shembull, megjithëse të dy disopiramidi dhe oryzalin mund të depolimerizojnë mikrotubulat, disopiramidi shkakton shtrembërim të rëndë të rrënjës ndërsa oryzalin ka një efekt relativisht të butë.Për më tepër, mutacionet në tubulinë, e cila stabilizon mikrotubulat, gjithashtu shkaktojnë dekstrorotacion në rrënjë, ndërsa paklitakseli, i cili gjithashtu stabilizon dinamikën e mikrotubulave, jo.Prandaj, studimi dhe identifikimi i objektivave molekularë të acidit ursolik duhet të sigurojë njohuri të reja në rregullimin e mikrotubulave kortikale të bimëve.Po kështu, krahasimet e ardhshme të kimikateve që janë efektive në nxitjen e rritjes së shtrembëruar, si disopiramidi, dhe kimikateve më pak efektive, si oryzalin ose acidi kumamotorik, do të japin të dhëna se si ndodh rritja e shtrembëruar.
Nga ana tjetër, rirregullimet citoskeletore të lidhura me mbrojtjen janë një mundësi tjetër për të shpjeguar citotoksicitetin e acidit ursonik.Infeksioni i një patogjeni ose futja e një shkaktari në qelizat bimore ndonjëherë shkakton shkatërrimin e citoskeletit dhe vdekjen e mëvonshme të qelizave29.Për shembull, kriptoksantina me prejardhje nga oomycete është raportuar se prish mikrotubulat dhe filamentet e aktinës përpara vdekjes së qelizave të duhanit, ngjashëm me atë që ndodh me trajtimin KAND30,31.Ngjashmëritë midis përgjigjeve mbrojtëse dhe përgjigjeve qelizore të shkaktuara nga acidi ursonik na shtynë të hipotezojmë se ato shkaktojnë procese të zakonshme qelizore, megjithëse është i dukshëm një efekt më i shpejtë dhe më i fortë i acidit ursonik sesa kriptoksantina.Megjithatë, studimet kanë treguar se ndërprerja e filamenteve të aktinës nxit vdekjen spontane të qelizave, e cila nuk shoqërohet gjithmonë me ndërprerje të mikrotubulave29.Për më tepër, mbetet për t'u parë nëse patogjeni ose shkaktari shkakton rritje të shtrembëruar të rrënjëve, siç bëjnë derivatet e acidit ursonik.Kështu, njohuritë molekulare që lidhin përgjigjet e mbrojtjes dhe citoskeletin janë një problem tërheqës për t'u trajtuar.Duke shfrytëzuar praninë e komponimeve me peshë të ulët molekulare që lidhen me acidin ursonik, si dhe një sërë derivatesh me fuqi të ndryshme, ato mund të ofrojnë mundësi për të synuar mekanizma të panjohur qelizor.
Të marra së bashku, zbulimi dhe aplikimi i komponimeve të reja që modulojnë dinamikën e mikrotubulave do të ofrojë metoda të fuqishme për të adresuar mekanizmat komplekse molekulare që qëndrojnë në themel të përcaktimit të formës së qelizave bimore.Në këtë kontekst, kompleksi i zhvilluar së fundmi, acidi urmotonik, i cili ndikon në mikrotubulat dhe filamente të aktinës dhe shkakton vdekjen e qelizave, mund të ofrojë një mundësi për të deshifruar lidhjen midis kontrollit të mikrotubulave dhe këtyre mekanizmave të tjerë.Kështu, analiza kimike dhe biologjike duke përdorur acidin urbenik do të na ndihmojë të kuptojmë mekanizmat rregullues molekularë që kontrollojnë citoskeletin e bimëve.
Inokuloni S. werraensis MK493-CF1 në një balonë Erlenmeyer me 500 mL me mbytje që përmban 110 mL mjedis farë i përbërë nga 2% (w/v) galaktozë, 2% (w/v) pastë esencë, 1% (w/v) përbërje Bacto .-sojton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) ekstrakt misri (KOGOSTCH Co., Ltd., Japoni), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 dhe 0.2% CaCO3 në ujë të dejonizuar.(pH 7.4 para sterilizimit).Kulturat e farës u inkubuan në një shaker rrotullues (180 rpm) në 27°C për 2 ditë.Kultivimi i prodhimit nëpërmjet fermentimit në gjendje të ngurtë.Kultura e farës (7 ml) u transferua në një balonë K-1 500 ml që përmban 40 g mjedis prodhimi të përbërë nga 15 g elbi të shtypur (MUSO Co., Ltd., Japoni) dhe 25 g ujë të deionizuar (pH i parregulluar para sterilizimit).).Fermentimi u krye në 30°C në errësirë për 14 ditë.Materiali i fermentimit u ekstraktua me 40 ml/shishe EtOH dhe u centrifugua (1500 g, 4°C, 10 min).Supernatanti i kulturës (60 ml) u ekstraktua me një përzierje prej 10% MeOH/EtOAc.Shtresa organike u avullua nën presion të reduktuar për të marrë një mbetje (59,5 mg), e cila iu nënshtrua HPLC me elucionin gradient (0-10 minuta: 90%) në një kolonë me fazë të kundërt (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × gjatësi 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minuta: 90% H2O/CH3CN deri në 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minuta: 90% H2O/EtOH, 45–155 minuta: 90% H2O /EtOH në 100% EtOH (gradient (gradient), 155-200 min: 100% EtOH) me një shpejtësi rrjedhje prej 1.5 ml/min, kumamonamidi (1, 36.0 mg) u izolua si një pluhur amorf i bardhë.
Kumamotoamide (1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H).), 4.08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ vlera e llogaritur: 141.0659, vlera e matur: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 157 cm
Farat e Kolumbisë (Col-0) u morën nga Qendra e Burimeve Biologjike Arabidopsis (ABRC) me leje për përdorim kërkimor.Farat Col-0 u shumuan dhe u mbajtën në kushtet tona laboratorike dhe u përdorën si bimë Arabidopsis të tipit të egër.Farat e Arabidopsis u sterilizuan në sipërfaqe dhe u kultivuan në mjedis gjysmë fortësie Murashige dhe Skoog që përmban 2% saharozë (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-morfolino) acid etanesulfonik (MES) ( Fujifilm Wako Pure C ).) dhe 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, në 23 °C dhe dritë konstante.Farat e mutantit phs1-1 u siguruan nga T. Hashimoto (Instituti i Shkencës dhe Teknologjisë Nara).
Farat e shtamit SR-1 u siguruan nga T. Hashimoto (Instituti i Shkencës dhe Teknologjisë Nara) dhe u përdorën si bimë duhani të tipit të egër.Farat e duhanit u sterilizuan në sipërfaqe dhe u zhytën në ujë steril për tre netë për të nxitur mbirjen, më pas u vendosën në një solucion gjysmë të fortë që përmban 2% saharozë, 0,05% (w/v) MES dhe 0,8% çamçakëz gellan (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.dhe medium Skoog) me pH 5.7 dhe inkubuar në 23°C nën dritë të vazhdueshme.
Strain Tak-1 u sigurua nga T. Kohchi (Universiteti i Kiotos) dhe u përdor si njësi eksperimentale standarde për studimin e mëlçisë.Gemma u mor nga bimë të kultivuara të sterilizuara dhe më pas u vendos në mjedis Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) që përmbante 1% saharozë dhe 0.3% çamçakëz gellan dhe u inkubua në 23°C nën dritë të vazhdueshme.
Qelizat BY-2 të duhanit (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) u siguruan nga S. Hasezawa (Universiteti i Tokios).Qelizat BY-2 u holluan 95-fish në mjedisin e modifikuar Linsmeier dhe Skoog dhe u plotësuan çdo javë me acid 2,4-diklorofenoksiacetik 32 .Pezullimi i qelizave u përzie në një tundës rrotullues në 130 rpm në 27°C në errësirë.Lani qelizat me vëllim 10 herë më të madh të mediumit të freskët dhe risuspendoni në të njëjtin medium.Linjat qelizore transgjenike BY-2 që shprehin në mënyrë të qëndrueshme shënuesin e mikrotubulave TagRFP-TUA6 ose shënuesin e filamentit të aktinës GFP-ABD2 nën promotorin 35S të virusit të mozaikut të lulelakrës u krijuan siç përshkruhet33,34,35.Këto linja qelizore mund të mirëmbahen dhe sinkronizohen duke përdorur procedura të ngjashme me ato të përdorura për linjën qelizore origjinale BY-2.
Qelizat HeLa u kulturuan në mediumin e modifikuar të Dulbecco's Eagle (DMEM) (Life Technologies) të plotësuar me 10% serum fetusi të gjedhit, 1,2 U/ml penicilinë dhe 1,2 μg/ml streptomicinë në një inkubator 37°C me 5% CO2.
Të gjitha eksperimentet e përshkruara në këtë dorëshkrim u kryen në përputhje me rregulloret dhe udhëzimet japoneze të biosigurisë.
Komponimet u tretën në sulfoksid dimetil (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) si tretësirë akumuluese dhe u holluan në mjedis MS për Arabidopsis dhe duhan ose në mjedis Gamborg B5 për mëlçinë.Për analizën e frenimit të rritjes së rrënjëve, më shumë se 10 fara për pjatë u mbollën në mjedis agar që përmban komponimet e treguara ose DMSO.Farërat u inkubuan në një dhomë rritjeje për 7 ditë.Janë fotografuar fidanët dhe është matur gjatësia e rrënjëve.Për analizën e mbirjes së Arabidopsis, 48 fara për pjatë u mbollën në mjedis agar që përmban përbërës 200 μM ose DMSO.Farat e Arabidopsis u rritën në një dhomë rritjeje dhe numri i fidanëve të mbirë u numërua 7 ditë pas mbirjes (dag).Për analizën e mbirjes së duhanit, 24 fara për pjatë u mbollën në mjedis agar që përmban 200 μM KAND ose DMSO.Farat e duhanit u rritën në një dhomë rritjeje dhe numri i fidanëve të mbirë u numërua pas 14 ditësh.Për analizën e frenimit të rritjes së mëlçisë, 9 embrione nga secila pjatë u vendosën në mjedis agar që përmban përqendrimet e treguara të KAND ose DMSO dhe u inkubuan në një dhomë rritjeje për 14 ditë.
Përdorni fidanë të lyer me 5 mg/ml jodur propidium (PI) për të vizualizuar organizimin e meristemit të rrënjës.Sinjalet PI u vëzhguan me mikroskop fluoreshent duke përdorur një mikroskop konfokal skanues lazer TCS SPE (Leica Microsystems).
Ngjyrosja histokimike e rrënjëve me β-glukuronidazë (GUS) u krye sipas protokollit të përshkruar nga Malami dhe Benfey36.Fidanët u fiksuan në aceton 90% gjatë natës, u ngjyrosën me 0.5 mg/ml 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-d-glukuronik acid në tampon GUS për 1 orë dhe u vendosën në një tretësirë të hidratuar kloraldehidi.(8 g hidrat klorali, 2 ml ujë dhe 1 ml glicerinë) dhe vëzhguar me mikroskop kontrasti me ndërhyrje diferenciale duke përdorur një mikroskop Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Këndet e rrënjëve u matën në fidanë 7-ditorë të rritur në pllaka të vendosura vertikalisht.Matni këndin e rrënjës nga drejtimi i vektorit të gravitetit siç përshkruhet në hapin 6.
Rregullimi i mikrotubulave kortikale u vëzhgua siç përshkruhet, me modifikime të vogla të protokollit 37 .Antitrupat anti-β-tubulinë (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) dhe IgG kundër miut të konjuguar me Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) u përdorën si antitrupa parësor dhe dytësor në hollimet 1:1000 dhe 1:100, përkatësisht.Imazhet me fluoreshencë u morën duke përdorur një mikroskop skanues lazer konfokal TCS SPE (Leica Microsystems).Merrni imazhe të stivës Z dhe krijoni parashikime të intensitetit maksimal sipas udhëzimeve të prodhuesit.
Analiza e proliferimit të qelizave HeLa u krye duke përdorur Cell Counting Kit 8 (Dojindo) sipas udhëzimeve të prodhuesit.
Rritja e E. coli DH5α u analizua duke matur densitetin e qelizave në kulturë duke përdorur një spektrofotometër në 600 nm (OD600).
Organizimi citoskeletor në qelizat transgjenike BY-2 u vëzhgua duke përdorur një mikroskop fluoreshent të pajisur me një pajisje skanimi konfokal CSU-X1 (Yokogawa) dhe një kamerë sCMOS (Zyla, Andor Technology).Dendësia citoskeletore u vlerësua nga analiza e imazhit, e cila përcaktoi përqindjen e pikselëve citoskeletorë midis pikselëve citoplazmikë në imazhet konfokale duke përdorur softuerin ImageJ siç përshkruhet38,39.
Për të zbuluar vdekjen e qelizave në qelizat BY-2, një pjesë e suspensionit qelizor u inkubua me 0.05% Evans blu për 10 minuta në temperaturën e dhomës.Ngjyrosja selektive blu e Evans e qelizave të vdekura varet nga nxjerrja e bojës nga qelizat e qëndrueshme nga membrana plazmatike e paprekur40.Qelizat e ngjyrosura u vëzhguan duke përdorur një mikroskop me fushë të ndritshme (BX53, Olympus).
Qelizat HeLa u rritën në DMEM të plotësuar me 10% FBS në një inkubator të lagështuar në 37°C dhe 5% CO2.Qelizat u trajtuan me 100 μM KAND 11, acid kumamonamik 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco) ose 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) për 6 orë në 37°C.Qelizat u fiksuan me MetOH për 10 minuta dhe më pas me acetat për 5 minuta në temperaturën e dhomës.Qelizat e fiksuara u inkubuan me antitrup primar β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) të holluar në 0.5% BSA/PBS për 2 orë, u lanë 3 herë me TBST dhe më pas u inkubuan me antitrup dhie Alexa Fluor.488 1 orë.– IgG e miut (Thermo Fisher Scientific: A11001) dhe 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) i holluar në 0,5% BSA/PBS.Pas larjes me TBST tre herë, qelizat e njollosura u vëzhguan në një mikroskop të përmbysur Nikon Eclipse Ti-E.Imazhet u kapën me një kamerë CCD të ftohur Hamamatsu ORCA-R2 duke përdorur softuerin MetaMorph (Pajisje Molekulare).
Koha e postimit: Qershor-17-2024