Nematodi i pishës është një endoparazit migrator në karantinë, i njohur për shkak të humbjeve të rënda ekonomike në ekosistemet e pyjeve me pisha. Studimi aktual shqyrton aktivitetin nematicid të indoleve të halogjenizuara kundër nematodeve të pishës dhe mekanizmin e veprimit të tyre. Aktivitetet nematicidale të 5-jodoindolit dhe avermektinës (kontroll pozitiv) kundër nematodave të pishës ishin të ngjashme dhe të larta në përqendrime të ulëta (10 μg/mL). 5-jodoindol reduktoi pjellorinë, aktivitetin riprodhues, vdekshmërinë embrionale dhe larvore dhe sjelljen lokomotore. Ndërveprimet molekulare të ligandëve me receptorët e kanalit të klorurit të mbyllur nga glutamatet specifike për jovertebrorët mbështesin nocionin se 5-jodoindol, si avermectina, lidhet fort me vendin aktiv të receptorit. 5-jodoindol gjithashtu shkaktoi deformime të ndryshme fenotipike në nematoda, duke përfshirë kolapsin/tkurrjen jonormale të organeve dhe rritjen e vakuolizimit. Këto rezultate sugjerojnë se vakuolat mund të luajnë një rol në vdekjen e ndërmjetësuar nga metilimi i nematodës. E rëndësishmja, 5-jodoindol ishte jo toksik për të dy llojet e bimëve (lakrën dhe rrepkën). Kështu, ky studim tregon se aplikimi i jodoindolit në kushte mjedisore mund të kontrollojë dëmtimin e pishës.
Nematoda e drurit të pishës (Bursaphelenchus xylophilus) i përket nematodave të drurit të pishës (PWN), nematodat endoparazitare migratore që dihet se shkaktojnë dëme të rënda ekologjike në ekosistemet e pyjeve me pisha1. Sëmundja e djegies së pishës (PWD) e shkaktuar nga nematodi i drurit të pishës po bëhet një problem serioz në disa kontinente, duke përfshirë Azinë dhe Evropën, dhe në Amerikën e Veriut, nematodi shkatërron speciet e futura të pishës1,2. Rënia e pishave është një problem i madh ekonomik dhe perspektiva e përhapjes së saj globale është shqetësuese3. Llojet e mëposhtme të pishave janë më së shpeshti të sulmuara nga nematodi: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii dhe Pinus radiata4. Nematoda e pishës është një sëmundje serioze që mund të vrasë pishat brenda javësh ose muajsh pas infektimit. Përveç kësaj, shpërthimet e nematodës së pishës janë të zakonshme në një shumëllojshmëri ekosistemesh, kështu që janë krijuar zinxhirë të vazhdueshëm infeksioni1.
Bursaphelenchus xylophilus është një nematod karantinë parazitar bimor që i përket superfamiljes Aphelenchoidea dhe kladit 102.5. Nematodi ushqehet me kërpudha dhe riprodhohet në indet e drurit të pishave, duke u zhvilluar në katër faza të ndryshme larvore: L1, L2, L3, L4 dhe një individ i rritur1,6. Në kushtet e mungesës së ushqimit, nematodi i pishës kalon në një stad të specializuar larvor - dauer, i cili parazitizon vektorin e tij - brumbullin e lëvores së pishës (Monochamus alternatus) dhe transferohet në pisha të shëndetshme. Në nikoqirët e shëndetshëm, nematodat migrojnë shpejt nëpër indet bimore dhe ushqehen me qeliza parenkimatike, gjë që çon në një sërë reaksionesh mbindjeshmërie, vyshkje të pishës dhe vdekje brenda një viti pas infektimit1,7,8.
Kontrolli biologjik i nematodave të pishës ka qenë prej kohësh një sfidë, me masa karantine që datojnë që nga shekulli i 20-të. Strategjitë aktuale për kontrollin e nematodave të pishës përfshijnë kryesisht trajtime kimike, duke përfshirë tymosjen e drurit dhe implantimin e nematikideve në trungjet e pemëve. Nematicidet më të përdorura janë avermectina dhe avermectin benzoate, të cilat i përkasin familjes së avermectinave. Këto kimikate të shtrenjta janë shumë efektive kundër shumë specieve nematode dhe konsiderohen të sigurta për mjedisin9. Megjithatë, përdorimi i përsëritur i këtyre nematicideve pritet të krijojë presion seleksionues që pothuajse me siguri do të çojë në shfaqjen e nematodave rezistente të pishës, siç është demonstruar për disa dëmtues të insekteve, si Leptinotarsa 'decemlineata, Plutella xylostella dhe nematodat Trichostrongylus colubriformis dhe Ostertagia kanë zhvilluar gradualisht rezistencë, avermektinat10,11,12. Prandaj, modelet e rezistencës duhet të studiohen rregullisht dhe nematicidet të ekzaminohen vazhdimisht për të gjetur masa alternative, me kosto efektive dhe miqësore me mjedisin për të kontrolluar PVD. Në dekadat e fundit, një numër autorësh kanë propozuar përdorimin e ekstrakteve bimore, vajrave esencialë dhe substancave të paqëndrueshme si agjentë të kontrollit të nematodeve13,14,15,16.
Kohët e fundit kemi demonstruar aktivitetin nematikid të indolit, një molekulë sinjalizuese ndërqelizore dhe ndërqelizore, në Caenorhabditis elegans 17 . Indoli është një sinjal ndërqelizor i përhapur në ekologjinë mikrobike, duke kontrolluar funksione të shumta që ndikojnë në fiziologjinë mikrobike, formimin e sporeve, stabilitetin e plazmideve, rezistencën ndaj ilaçeve, formimin e biofilmit dhe virulencën 18, 19 . Aktiviteti i indolit dhe derivateve të tij kundër nematodeve të tjera patogjene nuk është studiuar. Në këtë studim, ne hetuam aktivitetin nematikid të 34 indoleve kundër nematodave të pishës dhe sqaruam mekanizmin e veprimit të 5-jodoindolit më të fuqishëm duke përdorur mikroskopinë, fotografinë me kalimin e kohës dhe eksperimentet e lidhjes molekulare, dhe vlerësuam efektet e tij toksike në bimë duke përdorur një analizë të mbirjes së farës.
Përqendrimet e larta (>1.0 mM) të indolit janë raportuar më parë se kanë një efekt nematikid mbi nematodat17. Pas trajtimit të B. xylophilus (faza të përziera të jetës) me indol ose 33 derivate të ndryshëm të indolit në 1 mM, vdekshmëria e B. xylophilus u mat duke numëruar nematodat e gjalla dhe të vdekura në grupet e kontrollit dhe të trajtuar. Pesë indole shfaqën aktivitet të rëndësishëm nematicidal; mbijetesa e grupit të kontrollit të patrajtuar ishte 95 ± 7% pas 24 orësh. Nga 34 indolet e testuara, 5-jodoindol dhe 4-fluorindol në 1 mM shkaktuan 100% vdekshmëri, ndërsa 5,6-difluoroindigo, metilindol-7-karboksilate dhe 7-jodoindol shkaktuan afërsisht 50% vdekshmëri (Tabela 1).
Efekti i 5-jodoindolit në formimin e vakuolave dhe metabolizmin e nematodës së drurit të pishës. (A) Efekti i avermectinës dhe 5-jodoindolit te nematodat meshkuj të rritur, (B) vezët nematodë të fazës L1 dhe (C) metabolizmi i B. xylophilus, (i) vakuolat nuk u vunë re në 0 orë, trajtimi rezultoi në (ii) vakuola, (iii) akumulim vakuolash, pus (iv) vakuolash (iv) të shumëfishta shkrirja e vakuolave dhe (vi) formimi i vakuolave gjigante. Shigjetat e kuqe tregojnë fryrjen e vakuolave, shigjetat blu tregojnë shkrirjen e vakuolave dhe shigjetat e zeza tregojnë vakuolat gjigante. Shiriti i shkallës = 50 μm.
Përveç kësaj, ky studim përshkroi gjithashtu procesin sekuencial të vdekjes së shkaktuar nga metani në nematodat e pishës (Figura 4C). Vdekja metanogjenike është një lloj vdekjeje qelizore joapoptotike e lidhur me akumulimin e vakuolave të theksuara citoplazmike27. Defektet morfologjike të vërejtura në nematodat e pishës duket se janë të lidhura ngushtë me mekanizmin e vdekjes së shkaktuar nga metani. Ekzaminimi mikroskopik në kohë të ndryshme tregoi se vakuola gjigante u formuan pas 20 orësh ekspozimi ndaj 5-jodoindolit (0.1 mM). Vakuola mikroskopike u vëzhguan pas 8 orësh trajtimi dhe numri i tyre u rrit pas 12 orësh. Disa vakuola të mëdha janë vërejtur pas 14 orësh. Disa vakuola të shkrira ishin qartë të dukshme pas 12-16 orësh të trajtimit, duke treguar se shkrirja e vakuolave është baza e mekanizmit të vdekjes metanogjenike. Pas 20 orësh, disa vakuola gjigante u gjetën në të gjithë krimbin. Këto vëzhgime përfaqësojnë raportin e parë të metuozës në C. elegans.
Në krimbat e trajtuar me 5-jodoindol, u vu re gjithashtu grumbullimi dhe këputja e vakuolave (Fig. 5), siç dëshmohet nga përkulja e krimbit dhe lëshimi i vakuolave në mjedis. Përçarje vakuola u vu re gjithashtu në membranën e lëvozhgës së vezës, e cila normalisht ruhet e paprekur nga L2 gjatë çeljes (Fig. S2 plotësuese). Këto vëzhgime mbështesin përfshirjen e akumulimit të lëngjeve dhe dështimit osmorregullues, si dhe dëmtimit të kthyeshëm të qelizave (RCI), në procesin e formimit dhe suppurimit të vakuolës (Fig. 5).
Duke hipotezuar rolin e jodit në formimin e vakuolës së vëzhguar, ne hetuam aktivitetin nematicidal të jodidit të natriumit (NaI) dhe jodidit të kaliumit (KI). Megjithatë, në përqendrime (0,1, 0,5 ose 1 mM), ato nuk ndikuan as në mbijetesën e nematodës, as në formimin e vakuoleve (Figura Suplementare S5), megjithëse 1 mM KI kishte një efekt të lehtë nematikid. Nga ana tjetër, 7-jodoindol (1 ose 2 mM), si 5-jodoindol, shkaktoi vakuola të shumta dhe deformime strukturore (Figura suplementare S6). Dy jodoindolet treguan karakteristika të ngjashme fenotipike në nematodat e pishës, ndërsa NaI dhe KI jo. Është interesante se indoli nuk nxiti formimin e vakuolës në B. xylophilus në përqendrimet e testuara (të dhënat nuk tregohen). Kështu, rezultatet konfirmuan se kompleksi indol-jod është përgjegjës për vakuolizimin dhe metabolizmin e B. xylophilus.
Ndër indolet e testuara për aktivitet nematikid, 5-jodoindol kishte indeksin më të lartë të rrëshqitjes prej -5,89 kcal/mol, i ndjekur nga 7-jodoindol (-4,48 kcal/mol), 4-fluorindol (-4,33) dhe indol (-4,03) (Figura 6). Lidhja e fortë e hidrogjenit në shtyllën kurrizore të 5-jodoindolit me leucinën 218 stabilizon lidhjen e saj, ndërsa të gjithë derivatet e tjerë të indolit lidhen me serinën 260 nëpërmjet lidhjeve hidrogjenore të zinxhirit anësor. Ndër jodoindolet e tjera të modeluara, 2-jodoindol ka një vlerë lidhëse prej -5,248 kcal/mol, e cila është për shkak të lidhjes së tij kryesore hidrogjenore me leucinën 218. Lidhje të tjera të njohura përfshijnë 3-jodoindol (-4,3 kcal/mol), 4-jodoindol (-4,0 kcal/mol), dhe 6.-flundool (-4,0 kcal/mol) kcal/mol) (Figura suplementare S8). Shumica e indoleve të halogjenizuara dhe vetë indolit, me përjashtim të 5-jodoindolit dhe 2-jodoindolit, formojnë një lidhje me serinë 260. Fakti që lidhja hidrogjenore me leucinën 218 është tregues i lidhjes efikase të receptorit-ligandit, siç vërehet për ivermectinën (Suplementary Fig. 2-jodoindol, si ivermectin, lidhet fort me vendin aktiv të receptorit GluCL nëpërmjet leucinës 218 (Fig. 6 dhe Fig. S8 suplementar). Ne propozojmë që kjo lidhje të kërkohet për të ruajtur strukturën e poreve të hapura të kompleksit GluCL dhe që duke u lidhur fort me vendin aktiv të receptorit GluCL, 5-jodoindol, 2-jodoindol, avermectin dhe ivermectin, duke mbajtur kështu kanalin e joneve të hapur dhe të lejojë marrjen e lëngjeve.
Lidhja molekulare e indolit dhe indolit të halogjenuar në GluCL. Orientimet lidhëse të (A) indolit, (B) 4-fluorindolit, (C) 7-jodoindolit dhe (D) ligandëve 5-jodoindol në vendin aktiv të GluCL. Proteina përfaqësohet nga një fjongo dhe lidhjet hidrogjenore të shtyllës kurrizore tregohen si vija të verdha me pika. (A'), (B'), (C') dhe (D') tregojnë ndërveprimet e ligandëve përkatës me mbetjet e aminoacideve përreth, dhe lidhjet hidrogjenore të zinxhirit anësor tregohen me shigjeta me pika rozë.
Eksperimentet u kryen për të vlerësuar efektin toksik të 5-jodoindolit në mbirjen e farave të lakrës dhe rrepkës. 5-jodoindol (0.05 ose 0.1 mM) ose avermectin (10 μg/mL) patën pak ose aspak efekt në mbirjen fillestare dhe daljen e bimëve (Figura 7). Përveç kësaj, nuk u gjet asnjë ndryshim domethënës midis shkallës së mbirjes së kontrolleve të patrajtuara dhe farave të trajtuara me 5-jodoindol ose avermectin. Efekti në zgjatjen e rrënjëve dhe numrin e rrënjëve anësore të formuara ishte i parëndësishëm, megjithëse 1 mM (10 herë përqendrimi i tij aktiv) i 5-jodoindolit e vonoi pak zhvillimin e rrënjëve anësore. Këto rezultate tregojnë se 5-jodoindol është jotoksik për qelizat bimore dhe nuk ndërhyn në proceset e zhvillimit të bimëve në përqendrimet e studiuara.
Efekti i 5-jodoindolit në mbirjen e farës. Mbirja, mbirja dhe rrënjosja anësore e farave B. oleracea dhe R. raphanistrum në mjedisin Murashige dhe Skoog agar me ose pa avermectin ose 5-jodoindol. Mbirja u regjistrua pas 3 ditësh inkubacion në 22°C.
Ky studim raporton disa raste të vrasjes së nematodës nga indolet. E rëndësishmja, ky është raporti i parë i metilimit që nxit jodoindolin (një proces i shkaktuar nga akumulimi i vakuolave të vogla që shkrihen gradualisht në vakuola gjigante, duke çuar përfundimisht në këputje dhe vdekje të membranës) në gjilpërat e pishës, me jodoindolin që shfaq veti të rëndësishme nematicidale të ngjashme me ato të nematicidit averm tregtar.
Indolet janë raportuar më parë se ushtrojnë funksione të shumëfishta sinjalizuese në prokariote dhe eukariote, duke përfshirë frenimin/formimin e biofilmit, mbijetesën bakteriale dhe patogjenitetin19,32,33,34. Kohët e fundit, efektet e mundshme terapeutike të indoleve të halogjenizuara, alkaloideve indole dhe derivateve gjysmësintetike të indolit kanë tërhequr një interes të gjerë kërkimor35,36,37. Për shembull, indolet e halogjenizuara janë treguar se vrasin qelizat e vazhdueshme të Escherichia coli dhe Staphylococcus aureus37. Përveç kësaj, është me interes shkencor të studiohet efikasiteti i indoleve të halogjenizuara kundër specieve, gjinive dhe mbretërive të tjera, dhe ky studim është një hap drejt arritjes së këtij qëllimi.
Këtu, ne propozojmë një mekanizëm për vdekjen e shkaktuar nga 5-jodoindol në C. elegans bazuar në dëmtimin e kthyeshëm të qelizave (RCI) dhe metilimin (Figurat 4C dhe 5). Ndryshimet edematoze si fryrja dhe degjenerimi vakuolar janë tregues të RCI dhe metilimit, të manifestuara si vakuola gjigante në citoplazmë48,49. RCI ndërhyn në prodhimin e energjisë duke reduktuar prodhimin e ATP, duke shkaktuar dështim të pompës ATPase, ose duke prishur membranat qelizore dhe duke shkaktuar një fluks të shpejtë të Na+, Ca2+ dhe ujit50,51,52. Vakuolat intracitoplazmike lindin në qelizat shtazore si rezultat i akumulimit të lëngjeve në citoplazmë për shkak të fluksit të Ca2+ dhe ujit53. Është interesante se ky mekanizëm i dëmtimit të qelizave është i kthyeshëm nëse dëmtimi është i përkohshëm dhe qelizat fillojnë të prodhojnë ATP për një periudhë të caktuar kohe, por nëse dëmtimi vazhdon ose përkeqësohet, qelizat vdesin.54 Vëzhgimet tona tregojnë se nematodat e trajtuara me 5-jodoindol nuk janë në gjendje të rivendosin biosintezën normale pas ekspozimit ndaj kushteve të stresit.
Fenotipi i metilimit i shkaktuar nga 5-jodoindol në B. xylophilus mund të jetë për shkak të pranisë së jodit dhe shpërndarjes molekulare të tij, pasi 7-jodoindol kishte më pak efekt frenues mbi B. xylophilus sesa 5-jodoindol (Tabela 1 dhe Figura plotësuese S6). Këto rezultate janë pjesërisht në përputhje me studimet e Maltese et al. (2014), i cili raportoi se zhvendosja e pjesës së azotit piridil në indol nga pozicioni para-në meta hoqi vakuolizimin, frenimin e rritjes dhe citotoksicitetin në qelizat U251, duke sugjeruar që ndërveprimi i molekulës me një vend aktiv specifik në proteinë është kritik25,44,4. Ndërveprimet midis indoleve ose indoleve të halogjenizuara dhe receptorëve GluCL të vëzhguara në këtë studim gjithashtu mbështesin këtë nocion, pasi 5- dhe 2-jodoindol u zbulua se lidhet me receptorët GluCL më fort se indolet e tjera të ekzaminuara (Figura 6 dhe Figura S8 plotësuese). Jodi në pozicionin e dytë ose të pestë të indolit u zbulua se lidhet me leucinën 218 të receptorit GluCL nëpërmjet lidhjeve hidrogjenore të shtyllës kurrizore, ndërsa indolet e tjera të halogjenuara dhe vetë indoli formojnë lidhje të dobëta hidrogjeni të zinxhirit anësor me serinë 260 (Figura 6). Prandaj, ne spekulojmë se lokalizimi i halogjenit luan një rol të rëndësishëm në induksionin e degjenerimit vakuolar, ndërsa lidhja e ngushtë e 5-jodoindolit e mban kanalin jonik të hapur, duke lejuar rrjedhjen e shpejtë të lëngjeve dhe këputjen e vakuolës. Megjithatë, mekanizmi i detajuar i veprimit të 5-jodoindol mbetet për t'u përcaktuar.
Para aplikimit praktik të 5-jodoindolit, duhet të analizohet efekti i tij toksik në bimë. Eksperimentet tona të mbirjes së farës treguan se 5-jodoindol nuk kishte asnjë efekt negativ në mbirjen e farës ose në proceset e mëvonshme të zhvillimit në përqendrimet e studiuara (Figura 7). Kështu, ky studim ofron një bazë për përdorimin e 5-jodoindolit në mjedisin ekologjik për të kontrolluar dëmtimin e nematodave të pishës për pemët e pishave.
Raportet e mëparshme kanë treguar se terapia me bazë indoli përfaqëson një qasje të mundshme për të trajtuar problemin e rezistencës ndaj antibiotikëve dhe progresionit të kancerit55. Përveç kësaj, indolet posedojnë aktivitete antibakteriale, antikancerogjene, antioksidante, anti-inflamatore, antidiabetike, antivirale, antiproliferative dhe antituberkuloze dhe mund të shërbejnë si një bazë premtuese për zhvillimin e barnave56,57. Ky studim sugjeron për herë të parë përdorimin e mundshëm të jodit si një agjent antiparazitar dhe antihelmintik.
Avermectin u zbulua tre dekada më parë dhe fitoi çmimin Nobel në 2015, dhe përdorimi i saj si një antihelmintik është ende në vazhdim. Megjithatë, për shkak të zhvillimit të shpejtë të rezistencës ndaj avermektinave në nematodat dhe insektet dëmtuese, nevojitet një strategji alternative, me kosto të ulët dhe miqësore me mjedisin për të kontrolluar infeksionin e PWN në pishat. Ky studim raporton gjithashtu mekanizmin me të cilin 5-jodoindol vret nematodet e pishës dhe se 5-jodoindol ka toksicitet të ulët për qelizat bimore, gjë që hap perspektiva të mira për aplikimin e tij komercial në të ardhmen.
Të gjitha eksperimentet u miratuan nga Komiteti i Etikës i Universitetit Yeungnam, Gyeongsan, Kore, dhe metodat u kryen në përputhje me udhëzimet e Komitetit të Etikës të Universitetit Yeungnam.
Eksperimentet e inkubacionit të vezëve u kryen duke përdorur procedura të përcaktuara43. Për të vlerësuar shkallën e çeljes (HR), nematodat e rritur 1-ditore (afërsisht 100 femra dhe 100 meshkuj) u transferuan në enët Petri që përmbajnë kërpudhat dhe u lanë të rriteshin për 24 orë. Vezët më pas u izoluan dhe u trajtuan me 5-jodoindol (0.05 mM dhe 0.1 mM) ose avermectin (10 μg/ml) si suspension në ujë të distiluar steril. Këto suspensione (500 μl; afërsisht 100 vezë) u transferuan në puset e një pllake të kulturës së indeve me 24 puse dhe u inkubuan në 22 °C. Numërimi i L2 u bë pas 24 orësh inkubimi, por konsideroheshin të vdekur nëse qelizat nuk lëviznin kur stimuloheshin me një tel të imët platini. Ky eksperiment u krye në dy faza, secila me nga gjashtë përsëritje. Të dhënat nga të dy eksperimentet u kombinuan dhe u prezantuan. Përqindja e HR llogaritet si më poshtë:
Vdekshmëria e larvave u vlerësua duke përdorur procedura të zhvilluara më parë. Vezët e nematodës u mblodhën dhe embrionet u sinkronizuan duke u çelur në ujë të distiluar steril për të gjeneruar larva të fazës L2. Larvat e sinkronizuara (afërsisht 500 nematoda) u trajtuan me 5-jodoindol (0.05 mM dhe 0.1 mM) ose avermectin (10 μg/ml) dhe u rritën në pllaka Petri B. cinerea. Pas 48 orësh inkubimi në 22 °C, nematodat u mblodhën në ujë të distiluar steril dhe u ekzaminuan për praninë e fazave L2, L3 dhe L4. Prania e fazave L3 dhe L4 tregoi transformim larvor, ndërsa prania e fazës L2 nuk tregoi asnjë transformim. Imazhet janë marrë duke përdorur Sistemin e Imazhit Dixhital të Qelizës iRiS™. Ky eksperiment u krye në dy faza, secila me nga gjashtë përsëritje. Të dhënat nga të dy eksperimentet u kombinuan dhe u prezantuan.
Toksiciteti i 5-jodoindolit dhe avermektinës ndaj farave u vlerësua duke përdorur testet e mbirjes në pllakat Murashige dhe Skoog agar.62 Farat B. oleracea dhe R. raphanistrum fillimisht u zhytën në ujë të distiluar steril për një ditë, u lanë me 1 ml 100% etanol 100% të sterilizuar me 50% hipoklorit natriumi) për 15 min dhe lahet pesë herë me 1 ml ujë steril. Farat e sterilizuara u shtypën më pas në pllaka agar të mbirjes që përmbanin 0.86 g/l (0.2X) medium Murashige dhe Skoog dhe 0.7% agar bakteriologjik me ose pa 5-jodoindol ose avermectin. Pllakat më pas u inkubuan në 22 °C dhe imazhet u morën pas 3 ditësh inkubimi. Ky eksperiment u krye në dy faza, secila prej të cilave kishte gjashtë përsëritje.
Koha e postimit: Shkurt-26-2025