Nematoda e pishës është një endoparazit migrator karantine i njohur për shkaktimin e humbjeve të rënda ekonomike në ekosistemet e pyjeve të pishës. Studimi aktual shqyrton aktivitetin nematicid të indoleve të halogjenizuara kundër nematodave të pishës dhe mekanizmin e tyre të veprimit. Aktivitetet nematicidale të 5-jodoindolit dhe avermektinës (kontroll pozitiv) kundër nematodave të pishës ishin të ngjashme dhe të larta në përqendrime të ulëta (10 μg/mL). 5-jodoindoli uli pjellorinë, aktivitetin riprodhues, vdekshmërinë embrionale dhe larvore, dhe sjelljen lokomotore. Ndërveprimet molekulare të ligandeve me receptorët e kanalit të klorurit të glutamatit specifik për jovertebrorët mbështesin idenë se 5-jodoindoli, ashtu si avermektina, lidhet fort me vendin aktiv të receptorit. 5-jodoindoli gjithashtu shkaktoi deformime të ndryshme fenotipike në nematoda, duke përfshirë kolapsin/tkurrjen jonormale të organeve dhe rritjen e vakuolizimit. Këto rezultate sugjerojnë që vakuolat mund të luajnë një rol në vdekjen e ndërmjetësuar nga metilimi i nematodave. Është e rëndësishme të theksohet se 5-jodoindoli nuk ishte toksik për të dyja llojet e bimëve (lakër dhe rrepkë). Kështu, ky studim tregon se aplikimi i jodoindolit në kushte mjedisore mund të kontrollojë dëmtimin nga vyshkja e pishës.
Nematoda e pishës (Bursaphelenchus xylophilus) i përket nematodave të pishës (PWN), nematoda endoparazitare migratore të njohura për shkaktimin e dëmeve të rënda ekologjike në ekosistemet e pyjeve të pishës1. Sëmundja e vyshkjes së pishës (PWD) e shkaktuar nga nematoda e pishës po bëhet një problem serioz në disa kontinente, duke përfshirë Azinë dhe Evropën, dhe në Amerikën e Veriut, nematoda shkatërron speciet e pishës së futur1,2. Rënia e pemëve të pishës është një problem i madh ekonomik dhe perspektiva e përhapjes së saj globale është shqetësuese3. Speciet e mëposhtme të pishës sulmohen më shpesh nga nematoda: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii dhe Pinus radiata4. Nematoda e pishës është një sëmundje serioze që mund të vrasë pishat brenda javësh ose muajsh nga infeksioni. Përveç kësaj, shpërthimet e nematodave të pishës janë të zakonshme në një sërë ekosistemesh, kështu që janë krijuar zinxhirë të vazhdueshëm infeksioni1.
Bursaphelenchus xylophilus është një nematod karantine parazitar bimor që i përket superfamiljes Aphelenchoidea dhe kladit 102.5. Nematoda ushqehet me kërpudha dhe riprodhohet në indet e drurit të pishave, duke u zhvilluar në katër faza të ndryshme larvore: L1, L2, L3, L4 dhe një individ të rritur1,6. Në kushtet e mungesës së ushqimit, nematoda e pishës kalon në një fazë të specializuar larvore - dauer, e cila paraziton vektorin e saj - brumbullin e lëvores së pishës (Monochamus alternatus) dhe transferohet në pisha të shëndetshme. Tek pritësit e shëndetshëm, nematodat migrojnë shpejt nëpër indet e bimëve dhe ushqehen me qeliza parenkimatoze, gjë që çon në një numër reaksionesh të mbindjeshmërisë, vyshkje të pishës dhe vdekje brenda një viti pas infeksionit1,7,8.
Kontrolli biologjik i nematodave të pishave ka qenë prej kohësh një sfidë, me masa karantine që datojnë që nga shekulli i 20-të. Strategjitë aktuale për kontrollin e nematodave të pishave përfshijnë kryesisht trajtime kimike, duke përfshirë fumigimin e drurit dhe implantimin e nematicideve në trungjet e pemëve. Nematicidet më të përdorura janë avermektina dhe benzoati i avermektinës, të cilat i përkasin familjes së avermektinës. Këto kimikate të shtrenjta janë shumë efektive kundër shumë specieve të nematodave dhe konsiderohen të sigurta për mjedisin9. Megjithatë, përdorimi i përsëritur i këtyre nematicideve pritet të krijojë presion përzgjedhës që pothuajse me siguri do të çojë në shfaqjen e nematodave rezistente të pishave, siç është demonstruar për disa dëmtues insektesh, të tilla si Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella dhe nematodat Trichostrongylus colubriformis dhe Ostertagia circumcincta, të cilat kanë zhvilluar gradualisht rezistencë ndaj avermektinave10,11,12. Prandaj, modelet e rezistencës duhet të studiohen rregullisht dhe nematicidet të shqyrtohen vazhdimisht për të gjetur masa alternative, me kosto efektive dhe miqësore me mjedisin për të kontrolluar PVD-në. Në dekadat e fundit, një numër autorësh kanë propozuar përdorimin e ekstrakteve bimore, vajrave esencialë dhe substancave të avullueshme si agjentë të kontrollit të nematodave13,14,15,16.
Kohët e fundit kemi demonstruar aktivitetin nematicid të indolës, një molekulë sinjalizuese ndërqelizore dhe ndërmbretërore, në Caenorhabditis elegans 17. Indoli është një sinjal intraqelizor i përhapur në ekologjinë mikrobike, duke kontrolluar funksione të shumta që ndikojnë në fiziologjinë mikrobike, formimin e sporeve, stabilitetin e plazmideve, rezistencën ndaj ilaçeve, formimin e biofilmit dhe virulencën 18, 19. Aktiviteti i indolës dhe derivateve të saj kundër nematodave të tjera patogjene nuk është studiuar. Në këtë studim, ne hetuam aktivitetin nematicid të 34 indoleve kundër nematodave të pishës dhe sqaruam mekanizmin e veprimit të 5-jodoindolit më të fuqishëm duke përdorur mikroskopi, fotografi me interval kohor dhe eksperimente molekulare të lidhjes, dhe vlerësuam efektet e tij toksike në bimë duke përdorur një analizë të mbirjes së farave.
Përqendrimet e larta (>1.0 mM) të indolit janë raportuar më parë se kanë një efekt nematicid në nematodat17. Pas trajtimit të B. xylophilus (faza të përziera jete) me indol ose 33 derivate të ndryshme të indolit në 1 mM, vdekshmëria e B. xylophilus u mat duke numëruar nematodat e gjalla dhe të ngordhura në grupet e kontrollit dhe të trajtuara. Pesë indole shfaqën aktivitet të konsiderueshëm nematicid; mbijetesa e grupit të kontrollit të patrajtuar ishte 95 ± 7% pas 24 orësh. Nga 34 indolet e testuara, 5-jodoindoli dhe 4-fluoroindoli në 1 mM shkaktuan vdekshmëri 100%, ndërsa 5,6-difluoroindigo, metilindol-7-karboksilat dhe 7-jodoindoli shkaktuan vdekshmëri afërsisht 50% (Tabela 1).
Efekti i 5-jodoindolit në formimin e vakuolave dhe metabolizmin e nematodës së pishës. (A) Efekti i avermektinës dhe 5-jodoindolit në nematodat e rritura meshkuj, (B) vezët e nematodës së fazës L1 dhe (C) metabolizmi i B. xylophilus, (i) vakuolat nuk u vunë re në 0 orë, trajtimi rezultoi në (ii) vakuola, (iii) akumulim të vakuolave të shumëfishta, (iv) ënjtje të vakuolave, (v) bashkim të vakuolave dhe (vi) formimin e vakuolave gjigante. Shigjetat e kuqe tregojnë ënjtje të vakuolave, shigjetat blu tregojnë bashkim të vakuolave dhe shigjetat e zeza tregojnë vakuola gjigante. Shigjeta e shkallës = 50 μm.
Përveç kësaj, ky studim përshkroi gjithashtu procesin sekuencial të vdekjes së shkaktuar nga metani në nematodat e pishës (Figura 4C). Vdekja metanogjene është një lloj jo-apoptotik i vdekjes qelizore i shoqëruar me akumulimin e vakuolave citoplazmatike të spikatura27. Defektet morfologjike të vërejtura në nematodat e pishës duket se janë të lidhura ngushtë me mekanizmin e vdekjes së shkaktuar nga metani. Ekzaminimi mikroskopik në kohë të ndryshme tregoi se vakuola gjigante u formuan pas 20 orësh ekspozimi ndaj 5-jodoindolit (0.1 mM). Vakuolat mikroskopike u vunë re pas 8 orësh trajtimi, dhe numri i tyre u rrit pas 12 orësh. Disa vakuola të mëdha u vunë re pas 14 orësh. Disa vakuola të shkrira ishin qartë të dukshme pas 12-16 orësh trajtimi, duke treguar se bashkimi i vakuolave është baza e mekanizmit të vdekjes metanogjene. Pas 20 orësh, disa vakuola gjigante u gjetën në të gjithë krimbin. Këto vëzhgime përfaqësojnë raportin e parë të metuozës në C. elegans.
Tek krimbat e trajtuar me 5-jodoindol, u vu re gjithashtu grumbullimi dhe këputja e vakuolave (Fig. 5), siç dëshmohet nga përkulja e krimbave dhe çlirimi i vakuolave në mjedis. Prishja e vakuolave u vu re gjithashtu në membranën e guaskës së vezës, e cila normalisht ruhet e paprekur nga L2 gjatë çeljes (Fig. plotësuese S2). Këto vëzhgime mbështesin përfshirjen e akumulimit të lëngjeve dhe dështimit osmoregulues, si dhe dëmtimit të kthyeshëm të qelizave (RCI), në procesin e formimit të vakuolave dhe qelbëzimit (Fig. 5).
Duke hipotezuar rolin e jodit në formimin e vakuolave të vëzhguara, ne hetuam aktivitetin nematicid të jodurit të natriumit (NaI) dhe jodurit të kaliumit (KI). Megjithatë, në përqendrime (0.1, 0.5 ose 1 mM), ato nuk ndikuan as në mbijetesën e nematodave dhe as në formimin e vakuolave (Fig. plotësuese S5), megjithëse 1 mM KI kishte një efekt të lehtë nematicid. Nga ana tjetër, 7-jodoindoli (1 ose 2 mM), ashtu si 5-jodoindoli, shkaktoi vakuola të shumëfishta dhe deformime strukturore (Fig. plotësuese S6). Dy jodoindolet treguan karakteristika të ngjashme fenotipike në nematodat e pishave, ndërsa NaI dhe KI jo. Është interesante se indoli nuk shkaktoi formimin e vakuolave në B. xylophilus në përqendrimet e testuara (të dhënat nuk janë paraqitur). Kështu, rezultatet konfirmuan se kompleksi indoli-jod është përgjegjës për vakuolizimin dhe metabolizmin e B. xylophilus.
Ndër indolet e testuara për aktivitet nematicid, 5-jodoindoli kishte indeksin më të lartë të rrëshqitjes prej -5.89 kcal/mol, i ndjekur nga 7-jodoindoli (-4.48 kcal/mol), 4-fluoroindoli (-4.33) dhe indoli (-4.03) (Figura 6). Lidhja e fortë hidrogjenore e 5-jodoindolit me leucinën 218 stabilizon lidhjen e tij, ndërsa të gjitha derivatet e tjera të indolit lidhen me serinën 260 nëpërmjet lidhjeve hidrogjenore të zinxhirit anësor. Ndër jodoindolet e tjera të modeluara, 2-jodoindoli ka një vlerë lidhëse prej -5.248 kcal/mol, e cila është për shkak të lidhjes së tij kryesore hidrogjenore me leucinën 218. Lidhje të tjera të njohura përfshijnë 3-jodoindolin (-4.3 kcal/mol), 4-jodoindolin (-4.0 kcal/mol) dhe 6-fluoroindolin (-2.6 kcal/mol) (Figura plotësuese S8). Shumica e indoleve të halogjenizuara dhe vetë indolit, me përjashtim të 5-jodoindolit dhe 2-jodoindolit, formojnë një lidhje me serinën 260. Fakti që lidhja hidrogjenore me leucinën 218 është tregues i lidhjes efikase receptor-ligand, siç është vërejtur për ivermektinën (Fig. plotësuese S7), konfirmon se 5-jodoindol dhe 2-jodoindol, ashtu si ivermektina, lidhen fort me vendin aktiv të receptorit GluCL nëpërmjet leucinës 218 (Fig. 6 dhe Fig. plotësuese S8). Ne propozojmë që kjo lidhje është e nevojshme për të ruajtur strukturën me pore të hapura të kompleksit GluCL dhe se duke u lidhur fort me vendin aktiv të receptorit GluCL, 5-jodoindol, 2-jodoindol, avermektina dhe ivermektina kështu e mbajnë kanalin jonik të hapur dhe lejojnë thithjen e lëngjeve.
Lidhja molekulare e indolit dhe indolit të halogjenizuar me GluCL. Orientimet e lidhjes së ligandeve (A) indol, (B) 4-fluoroindol, (C) 7-jodoindol dhe (D) 5-jodoindol në vendin aktiv të GluCL. Proteina përfaqësohet nga një shirit, dhe lidhjet hidrogjenore të shtyllës kurrizore tregohen si vija të verdha me pika. (A′), (B′), (C′) dhe (D′) tregojnë ndërveprimet e ligandeve përkatëse me mbetjet e aminoacideve përreth, dhe lidhjet hidrogjenore të zinxhirit anësor tregohen me shigjeta rozë me pika.
U kryen eksperimente për të vlerësuar efektin toksik të 5-jodoindolit në mbirjen e farave të lakrës dhe rrepkës. 5-jodoindol (0.05 ose 0.1 mM) ose avermektina (10 μg/mL) kishin pak ose aspak efekt në mbirjen fillestare dhe shfaqjen e bimëve (Figura 7). Përveç kësaj, nuk u gjet asnjë ndryshim i rëndësishëm midis shkallës së mbirjes së kontrolleve të patrajtuara dhe farave të trajtuara me 5-jodoindol ose avermektinë. Efekti në zgjatjen e rrënjës kryesore dhe numrin e rrënjëve anësore të formuara ishte i parëndësishëm, megjithëse 1 mM (10 herë përqendrimi i tij aktiv) i 5-jodoindolit vonoi pak zhvillimin e rrënjëve anësore. Këto rezultate tregojnë se 5-jodoindol nuk është toksik për qelizat bimore dhe nuk ndërhyn në proceset e zhvillimit të bimëve në përqendrimet e studiuara.
Efekti i 5-jodoindolit në mbirjen e farës. Mbirja, mbirja dhe rrënjosja anësore e farave të B. oleracea dhe R. raphanistrum në mjedisin Murashige dhe Skoog agar me ose pa avermektinë ose 5-jodoindol. Mbirja u regjistrua pas 3 ditësh inkubimi në 22°C.
Ky studim raporton disa raste të vrasjes së nematodave nga indolet. Është e rëndësishme të theksohet se ky është raporti i parë i metilimit që shkakton jodoindoli (një proces i shkaktuar nga akumulimi i vakuolave të vogla që gradualisht bashkohen në vakuola gjigante, duke çuar përfundimisht në këputje dhe vdekje të membranës) në halat e pishës, me jodoindolin që shfaq veti të rëndësishme nematicide të ngjashme me ato të avermektinës nematicid komercial.
Më parë është raportuar se indolet ushtrojnë funksione të shumëfishta sinjalizuese në prokariotë dhe eukariote, duke përfshirë frenimin/formimin e biofilmit, mbijetesën bakteriale dhe patogjenitetin19,32,33,34. Kohët e fundit, efektet e mundshme terapeutike të indoleve të halogjenizuara, alkaloideve të indolit dhe derivateve gjysmësintetike të indolit kanë tërhequr interes të gjerë kërkimor35,36,37. Për shembull, indolet e halogjenizuara kanë treguar se vrasin qelizat persistente të Escherichia coli dhe Staphylococcus aureus37. Përveç kësaj, është me interes shkencor të studiohet efikasiteti i indoleve të halogjenizuara kundër specieve, gjinive dhe mbretërive të tjera, dhe ky studim është një hap drejt arritjes së këtij qëllimi.
Këtu, ne propozojmë një mekanizëm për vdekshmërinë e shkaktuar nga 5-jodoindol në C. elegans bazuar në dëmtimin e kthyeshëm të qelizave (RCI) dhe metilimin (Figurat 4C dhe 5). Ndryshimet edematoze si ënjtja dhe degjenerimi vakuolar janë tregues të RCI dhe metilimit, të manifestuara si vakuola gjigante në citoplazmë48,49. RCI ndërhyn në prodhimin e energjisë duke zvogëluar prodhimin e ATP-së, duke shkaktuar dështim të pompës së ATPazës, ose duke prishur membranat qelizore dhe duke shkaktuar një fluks të shpejtë të Na+, Ca2+ dhe ujit50,51,52. Vakuolat intracitoplazmike lindin në qelizat shtazore si rezultat i akumulimit të lëngjeve në citoplazmë për shkak të fluksit të Ca2+ dhe ujit53. Është interesante se ky mekanizëm i dëmtimit të qelizave është i kthyeshëm nëse dëmtimi është i përkohshëm dhe qelizat fillojnë të prodhojnë ATP për një periudhë të caktuar kohore, por nëse dëmtimi vazhdon ose përkeqësohet, qelizat vdesin.54 Vëzhgimet tona tregojnë se nematodat e trajtuara me 5-jodoindol nuk janë në gjendje të rivendosin biosintezën normale pas ekspozimit ndaj kushteve të stresit.
Fenotipi i metilimit i induktuar nga 5-jodoindoli në B. xylophilus mund të jetë për shkak të pranisë së jodit dhe shpërndarjes së tij molekulare, pasi 7-jodoindoli kishte më pak efekt frenues në B. xylophilus sesa 5-jodoindoli (Tabela 1 dhe Figura Plotësuese S6). Këto rezultate janë pjesërisht në përputhje me studimet e Maltese et al. (2014), të cilët raportuan se zhvendosja e pjesës së azotit piridil në indol nga pozicioni para- në meta- eliminoi vakuolizimin, frenimin e rritjes dhe citotoksicitetin në qelizat U251, duke sugjeruar që bashkëveprimi i molekulës me një vend aktiv specifik në proteinë është kritik27,44,45. Ndërveprimet midis indolit ose indoleve të halogjenizuara dhe receptorëve GluCL të vëzhguara në këtë studim gjithashtu mbështesin këtë ide, pasi 5- dhe 2-jodoindoli u gjetën të lidhen me receptorët GluCL më fort sesa indolet e tjera të ekzaminuara (Figura 6 dhe Figura Plotësuese S8). U zbulua se jodi në pozicionin e dytë ose të pestë të indolit lidhet me leucinën 218 të receptorit GluCL nëpërmjet lidhjeve hidrogjenore të shtyllës kurrizore, ndërsa indolet e tjera të halogjenizuara dhe vetë indoli formojnë lidhje të dobëta hidrogjenore të zinxhirit anësor me serinën 260 (Figura 6). Prandaj, ne spekulojmë se lokalizimi i halogjenit luan një rol të rëndësishëm në induksionin e degjenerimit vakuolar, ndërsa lidhja e ngushtë e 5-jodoindolit e mban kanalin jonik të hapur, duke lejuar kështu fluksin e shpejtë të lëngjeve dhe këputjen e vakuolës. Megjithatë, mekanizmi i detajuar i veprimit të 5-jodoindolit mbetet për t'u përcaktuar.
Përpara zbatimit praktik të 5-jodoindolit, duhet të analizohet efekti i tij toksik në bimë. Eksperimentet tona të mbirjes së farave treguan se 5-jodoindol nuk kishte efekt negativ në mbirjen e farave ose në proceset e mëvonshme të zhvillimit në përqendrimet e studiuara (Figura 7). Kështu, ky studim ofron një bazë për përdorimin e 5-jodoindolit në mjedisin ekologjik për të kontrolluar dëmin e nematodave të pishave për pemët e pishave.
Raportet e mëparshme kanë treguar se terapia me bazë indol përfaqëson një qasje të mundshme për të adresuar problemin e rezistencës ndaj antibiotikëve dhe përparimin e kancerit55. Përveç kësaj, indolet posedojnë aktivitete antibakteriale, antikancerogjene, antioksiduese, antiinflamatore, antidiabetike, antivirale, antiproliferative dhe antituberkuloze dhe mund të shërbejnë si një bazë premtuese për zhvillimin e barnave56,57. Ky studim sugjeron për herë të parë përdorimin potencial të jodit si një agjent antiparazitar dhe anthelmintik.
Avermectina u zbulua tre dekada më parë dhe fitoi Çmimin Nobel në vitin 2015, dhe përdorimi i saj si anthelmintik është ende në vazhdim aktiv. Megjithatë, për shkak të zhvillimit të shpejtë të rezistencës ndaj avermektinave te nematodat dhe dëmtuesit e insekteve, nevojitet një strategji alternative, me kosto të ulët dhe miqësore me mjedisin për të kontrolluar infeksionin PWN te pishat. Ky studim raporton gjithashtu mekanizmin me të cilin 5-jodoindoli vret nematodat e pishave dhe se 5-jodoindoli ka toksicitet të ulët ndaj qelizave bimore, gjë që hap perspektiva të mira për aplikimin e saj të ardhshëm komercial.
Të gjitha eksperimentet u miratuan nga Komiteti i Etikës i Universitetit Yeungnam, Gyeongsan, Kore, dhe metodat u kryen në përputhje me udhëzimet e Komitetit të Etikës të Universitetit Yeungnam.
Eksperimentet e inkubacionit të vezëve u kryen duke përdorur procedurat e përcaktuara43. Për të vlerësuar shkallët e çeljes (HR), nematodat e rritura 1-ditore (afërsisht 100 femra dhe 100 meshkuj) u transferuan në enët Petri që përmbanin kërpudhat dhe u lanë të rriteshin për 24 orë. Vezët u izoluan dhe u trajtuan me 5-jodoindol (0.05 mM dhe 0.1 mM) ose avermektinë (10 μg/ml) si një pezullim në ujë të distiluar steril. Këto pezullime (500 μl; afërsisht 100 vezë) u transferuan në pusetat e një pllake të kulturës së indeve me 24 puseta dhe u inkubuan në 22 °C. Numërimet L2 u bënë pas 24 orësh inkubimi, por u konsideruan të vdekura nëse qelizat nuk lëviznin kur stimuloheshin me një tel të hollë platini. Ky eksperiment u krye në dy faza, secila me gjashtë përsëritje. Të dhënat nga të dy eksperimentet u kombinuan dhe u paraqitën. Përqindja e HR llogaritet si më poshtë:
Vdekshmëria e larvave u vlerësua duke përdorur procedura të zhvilluara më parë. Vezët e nematodave u mblodhën dhe embrionet u sinkronizuan duke u çelur në ujë të distiluar steril për të gjeneruar larva të fazës L2. Larvat e sinkronizuara (afërsisht 500 nematoda) u trajtuan me 5-jodoindol (0.05 mM dhe 0.1 mM) ose avermektinë (10 μg/ml) dhe u rritën në pllaka Petri të B. cinerea. Pas 48 orësh inkubimi në 22 °C, nematodat u mblodhën në ujë të distiluar steril dhe u ekzaminuan për praninë e fazave L2, L3 dhe L4. Prania e fazave L3 dhe L4 tregoi transformim larval, ndërsa prania e fazës L2 tregoi mungesë transformimi. Imazhet u morën duke përdorur Sistemin e Imazheve të Qelizave Dixhitale iRiS™. Ky eksperiment u krye në dy faza, secila me gjashtë përsëritje. Të dhënat nga të dy eksperimentet u kombinuan dhe u prezantuan.
Toksiciteti i 5-jodoindolit dhe avermektinës për farat u vlerësua duke përdorur testet e mbirjes në pllakat e agarit Murashige dhe Skoog.62 Farat e B. oleracea dhe R. raphanistrum u zhytën fillimisht në ujë të distiluar steril për një ditë, u lanë me 1 ml etanol 100%, u sterilizuan me 1 ml zbardhues komercial 50% (3% hipoklorit natriumi) për 15 minuta dhe u lanë pesë herë me 1 ml ujë steril. Farat e sterilizuara u shtypën më pas në pllaka agar mbirjeje që përmbanin 0.86 g/l (0.2X) mjedis Murashige dhe Skoog dhe 0.7% agar bakteriologjik me ose pa 5-jodoindol ose avermektinë. Pllakat u inkubuan më pas në 22 °C dhe imazhet u morën pas 3 ditësh inkubimi. Ky eksperiment u krye në dy faza, secila prej të cilave kishte gjashtë përsëritje.
Koha e postimit: 26 shkurt 2025