Rritja e meristemit apikal të lastarëve (SAM) është kritike për arkitekturën e kërcellit. Hormonet bimore.giberelina(GA) luajnë role kyçe në koordinimin e rritjes së bimëve, por roli i tyre në SAM mbetet i pakuptuar. Këtu, ne zhvilluam një biosensor ratiometrik të sinjalizimit GA duke inxhinieruar proteinën DELLA për të shtypur funksionin e saj thelbësor rregullator në përgjigjen transkriptuese të GA duke ruajtur degradimin e saj pas njohjes së GA. Ne demonstrojmë se ky biosensor i bazuar në degradim regjistron me saktësi ndryshimet në nivelet e GA dhe ndjeshmërinë qelizore gjatë zhvillimit. Ne përdorëm këtë biosensor për të hartuar aktivitetin e sinjalizimit GA në SAM. Ne tregojmë se sinjalet e larta GA janë të pranishme kryesisht në qelizat e vendosura midis primordieve të organeve, të cilat janë pararendëse të qelizave internode. Duke përdorur qasje të fitimit dhe humbjes së funksionit, ne demonstrojmë më tej se GA rregullon orientimin e planit të ndarjes qelizore, duke vendosur organizimin kanonik qelizor të internodeve, duke promovuar kështu specifikimin e internodës në SAM.
Meristemi apikal i lastarit (SAM), i vendosur në majën e lastarit, përmban një vend qelizash staminale, aktiviteti i të cilave gjeneron organe anësore dhe nyje kërcelli në një mënyrë modulare dhe iterative gjatë gjithë jetës së bimës. Secila prej këtyre njësive përsëritëse, ose nyjeve bimore, përfshin internode dhe organe anësore në nyje, dhe meristeme sqetullore në sqetullat e gjetheve1. Rritja dhe organizimi i nyjeve të bimëve ndryshon gjatë zhvillimit. Në Arabidopsis, rritja internodale shtypet gjatë fazës vegjetative, dhe meristemet sqetullore mbeten në gjumë në sqetullat e gjetheve të rozetës. Gjatë kalimit në fazën e lules, SAM bëhet meristemi i inflorescencës, duke gjeneruar internode të zgjatura dhe sytha sqetullore, degëza në sqetullat e gjetheve të lules së detit dhe më vonë, lule pa gjethe2. Edhe pse kemi bërë përparim të konsiderueshëm në kuptimin e mekanizmave që kontrollojnë fillimin e gjetheve, luleve dhe degëve, dihet relativisht pak se si lindin internodet.
Kuptimi i shpërndarjes hapësinore-kohore të GA-ve do të ndihmojë në kuptimin më të mirë të funksioneve të këtyre hormoneve në inde të ndryshme dhe në faza të ndryshme zhvillimore. Vizualizimi i degradimit të bashkimit RGA-GFP të shprehur nën veprimin e promotorit të vet ofron informacion të rëndësishëm mbi rregullimin e niveleve totale të GA-së në rrënjë15,16. Megjithatë, shprehja e RGA-së ndryshon në të gjitha indet17 dhe rregullohet nga GA18. Kështu, shprehja diferenciale e promotorit RGA mund të rezultojë në modelin e fluoreshencës së vëzhguar me RGA-GFP dhe kështu kjo metodë nuk është sasiore. Kohët e fundit, GA19,20 e shënuar me fluoresceinë bioaktive (Fl) zbuloi akumulimin e GA-së në endokorteksin e rrënjës dhe rregullimin e niveleve të saj qelizore nga transporti i GA-së. Kohët e fundit, sensori GA FRET nlsGPS1 tregoi se nivelet e GA-së korrelojnë me zgjatjen e qelizave në rrënjë, filamente dhe hipokotile të rritura në errësirë21. Megjithatë, siç e kemi parë, përqendrimi i GA-së nuk është i vetmi parametër që kontrollon aktivitetin e sinjalizimit të GA-së, pasi varet nga proceset komplekse të ndjeshmërisë. Këtu, duke u bazuar në kuptimin tonë të rrugëve të sinjalizimit DELLA dhe GA, ne raportojmë zhvillimin dhe karakterizimin e një biosensori ratiometrik të bazuar në degradim për sinjalizimin GA. Për të zhvilluar këtë biosensor sasior, ne përdorëm një RGA mutante të ndjeshme ndaj GA që ishte shkrirë me një proteinë fluoreshente dhe shprehej kudo në inde, si dhe një proteinë fluoreshente të pandjeshme ndaj GA. Ne tregojmë se bashkimet e proteinave mutante RGA nuk ndërhyjnë në sinjalizimin endogjen GA kur shprehen kudo, dhe se ky biosensor mund të përcaktojë sasinë e aktivitetit të sinjalizimit që rezulton si nga hyrja GA ashtu edhe nga përpunimi i sinjalit GA nga aparati ndijor me rezolucion të lartë hapësinor-kohor. Ne përdorëm këtë biosensor për të hartuar shpërndarjen hapësinor-kohor të aktivitetit të sinjalizimit GA dhe për të përcaktuar sasinë se si GA rregullon sjelljen qelizore në epidermën SAM. Ne demonstrojmë se GA rregullon orientimin e planit të ndarjes së qelizave SAM të vendosura midis primordive të organeve, duke përcaktuar kështu organizimin kanonik qelizor të internodës.
Së fundmi, ne pyetëm nëse qmRGA mund të raportonte ndryshime në nivelet endogjene të GA duke përdorur hipokotile në rritje. Më parë treguam se nitrati stimulon rritjen duke rritur sintezën e GA dhe, nga ana tjetër, degradimin e DELLA34. Prandaj, ne vumë re se gjatësia e hipokotilit në fidanët pUBQ10::qmRGA të rritur nën furnizim të bollshëm me nitrat (10 mM NO3−) ishte dukshëm më e gjatë se ajo në fidanët e rritur në kushte me mungesë nitratesh (Fig. 6a plotësuese). Në përputhje me përgjigjen e rritjes, sinjalet GA ishin më të larta në hipokotilet e fidanëve të rritur në kushte 10 mM NO3− sesa në fidanët e rritur në mungesë të nitratit (Fig. 6b, c plotësuese). Kështu, qmRGA gjithashtu mundëson monitorimin e ndryshimeve në sinjalizimin GA të shkaktuara nga ndryshimet endogjene në përqendrimin e GA.
Për të kuptuar nëse aktiviteti i sinjalizimit GA i zbuluar nga qmRGA varet nga përqendrimi i GA dhe perceptimi i GA, siç pritej bazuar në dizajnin e sensorit, ne analizuam shprehjen e tre receptorëve GID1 në indet vegjetative dhe riprodhuese. Në fidanë, linja raportuese GID1-GUS tregoi se GID1a dhe c ishin shprehur shumë në kotiledonë (Fig. 3a–c). Përveç kësaj, të tre receptorët u shprehën në gjethe, primordia anësore të rrënjës, majat e rrënjës (përveç kapakut të rrënjës së GID1b) dhe sistemin vaskular (Fig. 3a–c). Në SAM të inflorescencës, ne zbuluam sinjale GUS vetëm për GID1b dhe 1c (Fig. Plotësuese 7a–c). Hibridizimi in situ konfirmoi këto modele shprehjeje dhe tregoi më tej se GID1c ishte shprehur në mënyrë uniforme në nivele të ulëta në SAM, ndërsa GID1b tregoi shprehje më të lartë në periferi të SAM (Fig. Plotësuese 7d–l). Bashkimi përkthyes pGID1b::2xmTQ2-GID1b zbuloi gjithashtu një gamë të graduar të shprehjes së GID1b, nga shprehje e ulët ose aspak në qendër të SAM deri në shprehje të lartë në kufijtë e organeve (Fig. Plotësuese 7m). Kështu, receptorët GID1 nuk janë të shpërndarë në mënyrë uniforme nëpër dhe brenda indeve. Në eksperimentet pasuese, ne gjithashtu vumë re se shprehja e tepërt e GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) rriti ndjeshmërinë e qmRGA në hipokotile ndaj aplikimit të jashtëm të GA (Fig. 3d, e). Në të kundërt, fluoreshenca e matur nga qd17mRGA në hipokotil ishte e pandjeshme ndaj trajtimit GA3 (Fig. 3f, g). Për të dy analizat, fidanët u trajtuan me përqendrime të larta të GA (100 μM GA3) për të vlerësuar sjelljen e shpejtë të sensorit, ku aftësia për t'u lidhur me receptorin GID1 u rrit ose humbi. Së bashku, këto rezultate konfirmojnë që biosensori qmRGA shërben një funksion të kombinuar si një sensor GA dhe GA, dhe sugjerojnë që shprehja diferenciale e receptorit GID1 mund të modulojë ndjeshëm emisivitetin e sensorit.
Deri më sot, shpërndarja e sinjaleve GA në SAM mbetet e paqartë. Prandaj, ne përdorëm bimë që shprehin qmRGA dhe raportuesin e qelizave staminale pCLV3::mCherry-NLS35 për të llogaritur harta sasiore me rezolucion të lartë të aktivitetit të sinjalizimit GA, duke u përqendruar në shtresën L1 (epidermë; Fig. 4a, b, shih Metodat dhe Metodat Plotësuese), pasi L1 luan një rol kyç në kontrollin e rritjes së SAM36. Këtu, shprehja pCLV3::mCherry-NLS siguroi një pikë referimi gjeometrike fikse për analizimin e shpërndarjes hapësinore-kohore të aktivitetit të sinjalizimit GA37. Megjithëse GA konsiderohet thelbësore për zhvillimin e organeve anësore4, ne vumë re se sinjalet GA ishin të ulëta në primordiumin lulesh (P) duke filluar nga faza P3 (Fig. 4a, b), ndërsa primordiumet e reja P1 dhe P2 kishin aktivitet të moderuar të ngjashëm me atë në rajonin qendror (Fig. 4a, b). Aktiviteti më i lartë i sinjalizimit GA u zbulua në kufijtë e primordiumit të organeve, duke filluar në P1/P2 (në anët e kufirit) dhe duke arritur kulmin në P4, si dhe në të gjitha qelizat e rajonit periferik të vendosur midis primordiumeve (Fig. 4a, b dhe Fig. Plotësuese 8a, b). Ky aktivitet më i lartë i sinjalizimit GA u vu re jo vetëm në epidermë, por edhe në shtresat L2 dhe L3 të sipërme (Fig. Plotësuese 8b). Modeli i sinjaleve GA të zbuluara në SAM duke përdorur qmRGA gjithashtu mbeti i pandryshuar me kalimin e kohës (Fig. Plotësuese 8c–f, k). Megjithëse konstruksioni qd17mRGA u ul sistematikisht në SAM të bimëve T3 nga pesë linja të pavarura që i karakterizuam në detaje, ne ishim në gjendje të analizonim modelet e fluoreshencës të marra me konstruksionin pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Fig. Plotësuese 8g–j, l). Në këtë linjë kontrolli, në SAM u zbuluan vetëm ndryshime të vogla në raportin e fluoreshencës, por në qendrën e SAM vumë re një rënie të qartë dhe të papritur të VENUS të shoqëruar me TagBFP. Kjo konfirmon që modeli i sinjalizimit i vëzhguar nga qmRGA pasqyron degradimin e varur nga GA të mRGA-VENUS, por gjithashtu tregon se qmRGA mund të mbivlerësojë aktivitetin e sinjalizimit GA në qendrën e meristemit. Si përmbledhje, rezultatet tona zbulojnë një model sinjalizimi GA që pasqyron kryesisht shpërndarjen e primordieve. Kjo shpërndarje e rajonit ndër-primordial (IPR) është për shkak të vendosjes graduale të aktivitetit të lartë të sinjalizimit GA midis primordiumit në zhvillim dhe rajonit qendror, ndërsa në të njëjtën kohë aktiviteti i sinjalizimit GA në primordium zvogëlohet (Fig. 4c, d).
Shpërndarja e receptorëve GID1b dhe GID1c (shih më sipër) sugjeron që shprehja diferenciale e receptorëve GA ndihmon në formësimin e modelit të aktivitetit të sinjalizimit GA në SAM. Ne pyetëm veten nëse akumulimi diferencial i GA mund të jetë i përfshirë. Për të hetuar këtë mundësi, ne përdorëm sensorin nlsGPS1 GA FRET21. Frekuenca e shtuar e aktivizimit u zbulua në SAM të nlsGPS1 të trajtuar me 10 μM GA4+7 për 100 minuta (Fig. plotësuese 9a-e), duke treguar se nlsGPS1 i përgjigjet ndryshimeve në përqendrimin e GA në SAM, ashtu siç bën në rrënjë21. Shpërndarja hapësinore e frekuencës së aktivizimit të nlsGPS1 zbuloi nivele relativisht të ulëta të GA në shtresat e jashtme të SAM, por tregoi se ato ishin të ngritura në qendër dhe në kufijtë e SAM (Fig. 4e dhe Fig. plotësuese 9a,c). Kjo sugjeron që GA është gjithashtu e shpërndarë në SAM me një model hapësinor të krahasueshëm me atë të zbuluar nga qmRGA. Si një qasje plotësuese, ne trajtuam gjithashtu SAM me GA fluoreshente (GA3-, GA4-, GA7-Fl) ose vetëm Fl si kontroll negativ. Sinjali Fl u shpërnda në të gjithë SAM, duke përfshirë rajonin qendror dhe primordiumin, megjithëse me një intensitet më të ulët (Fig. 4j dhe Fig. Plotësuese 10d). Në të kundërt, të tre GA-Fl u akumuluan posaçërisht brenda kufijve të primordiumit dhe në shkallë të ndryshme në pjesën tjetër të IPR, me GA7-Fl që akumulohej në domenin më të madh në IPR (Fig. 4k dhe Fig. Plotësuese 10a,b). Kuantifikimi i intensitetit të fluoreshencës zbuloi se raporti i intensitetit IPR ndaj jo-IPR ishte më i lartë në SAM të trajtuar me GA-Fl krahasuar me SAM të trajtuar me Fl (Fig. 4l dhe Fig. Plotësuese 10c). Së bashku, këto rezultate sugjerojnë që GA është i pranishëm në përqendrime më të larta në qelizat IPR që ndodhen më afër kufirit të organit. Kjo sugjeron që modeli i aktivitetit të sinjalizimit SAM GA rezulton si nga shprehja diferenciale e receptorëve GA ashtu edhe nga akumulimi diferencial i GA në qelizat IPR pranë kufijve të organeve. Kështu, analiza jonë zbuloi një model të papritur hapësinor-kohor të sinjalizimit GA, me aktivitet më të ulët në qendër dhe primordium të SAM dhe aktivitet më të lartë në IPR në rajonin periferik.
Për të kuptuar rolin e aktivitetit diferencial të sinjalizimit GA në SAM, ne analizuam korrelacionin midis aktivitetit të sinjalizimit GA, zgjerimit të qelizave dhe ndarjes qelizore duke përdorur imazhe me interval kohor në kohë reale të SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Duke pasur parasysh rolin e GA në rregullimin e rritjes, pritej një korrelacion pozitiv me parametrat e zgjerimit të qelizave. Prandaj, së pari krahasuam hartat e aktivitetit të sinjalizimit GA me hartat e shkallës së rritjes së sipërfaqes qelizore (si një përfaqësim për forcën e zgjerimit të qelizave për një qelizë të caktuar dhe për qelizat bija në ndarje) dhe me hartat e anizotropisë së rritjes, e cila mat drejtimin e zgjerimit të qelizave (e përdorur gjithashtu këtu për një qelizë të caktuar dhe për qelizat bija në ndarje; Fig. 5a,b, shih Metodat dhe Metodat Plotësuese). Hartat tona të shkallës së rritjes së sipërfaqes së qelizave SAM janë në përputhje me vëzhgimet e mëparshme38,39, me shkallë minimale rritjeje në kufi dhe shkallë maksimale rritjeje në lulet në zhvillim (Fig. 5a). Analiza kryesore e komponentëve (PCA) tregoi se aktiviteti i sinjalizimit GA ishte negativisht i lidhur me intensitetin e rritjes së sipërfaqes qelizore (Figura 5c). Ne gjithashtu treguam se boshtet kryesore të variacionit, duke përfshirë hyrjen e sinjalizimit GA dhe intensitetin e rritjes, ishin ortogonale me drejtimin e përcaktuar nga shprehja e lartë e CLV3, duke konfirmuar përjashtimin e qelizave nga qendra SAM në analizat e mbetura. Analiza e korrelacionit Spearman konfirmoi rezultatet e PCA (Figura 5d), duke treguar se sinjalet më të larta GA në IPR nuk rezultuan në zgjerim më të lartë të qelizave. Megjithatë, analiza e korrelacionit zbuloi një korrelacion të lehtë pozitiv midis aktivitetit të sinjalizimit GA dhe anizotropisë së rritjes (Figura 5c, d), duke sugjeruar që sinjalizimi më i lartë GA në IPR ndikon në drejtimin e rritjes së qelizave dhe ndoshta në pozicionin e planit të ndarjes qelizore.
a, b Hartat e nxehtësisë së rritjes mesatare sipërfaqësore (a) dhe anizotropisë së rritjes (b) në SAM u mesatarizuan mbi shtatë bimë të pavarura (të përdorura si përfaqësues për forcën dhe drejtimin e zgjerimit të qelizave, përkatësisht). c Analiza PCA përfshinte variablat e mëposhtme: sinjalin GA, intensitetin e rritjes sipërfaqësore, anizotropinë e rritjes sipërfaqësore dhe shprehjen e CLV3. Komponenti 1 i PCA ishte kryesisht i korreluar negativisht me intensitetin e rritjes sipërfaqësore dhe i korreluar pozitivisht me sinjalin GA. Komponenti 2 i PCA ishte kryesisht i korreluar pozitivisht me anizotropinë e rritjes sipërfaqësore dhe i korreluar negativisht me shprehjen e CLV3. Përqindjet përfaqësojnë ndryshimin e shpjeguar nga secili komponent. d Analiza e korrelacionit Spearman midis sinjalit GA, intensitetit të rritjes sipërfaqësore dhe anizotropisë së rritjes sipërfaqësore në shkallën e indeve duke përjashtuar CZ. Numri në të djathtë është vlera Spearman rho midis dy variablave. Yjet tregojnë rastet kur korrelacioni/korrelacioni negativ është shumë i rëndësishëm. e Vizualizimi 3D i qelizave Col-0 SAM L1 me anë të mikroskopisë konfokale. Muret e reja qelizore të formuara në SAM (por jo në primordium) në 10 orë janë ngjyrosur sipas vlerave të tyre të këndit. Shiriti i ngjyrave tregohet në këndin e poshtëm të djathtë. Figura e brendshme tregon imazhin përkatës 3D në 0 orë. Eksperimenti u përsërit dy herë me rezultate të ngjashme. f Grafikët me kuti shfaqin shkallët e ndarjes qelizore në SAM IPR dhe jo-IPR Col-0 (n = 10 bimë të pavarura). Vija qendrore tregon medianën, dhe kufijtë e kutisë tregojnë percentilet e 25-të dhe 75-të. Mustaqet tregojnë vlerat minimale dhe maksimale të përcaktuara me softuerin R. Vlerat P u morën me testin t me dy bishta të Welch. g, h Diagrami skematik që tregon (g) si të matet këndi i murit të ri qelizor (magenta) në lidhje me drejtimin radial nga qendra e SAM (vija e bardhë me pika) (merren në konsideratë vetëm vlerat e këndit akut, d.m.th., 0–90°), dhe (h) drejtimet rrethore/laterale dhe radiale brenda meristemit. i Histogramet e frekuencës së orientimit të planit të ndarjes qelizore përgjatë SAM (blu e errët), IPR (blu mesatare) dhe jo-IPR (blu e çelët), përkatësisht. Vlerat P u morën nga një test Kolmogorov-Smirnov me dy bishta. Eksperimenti u përsërit dy herë me rezultate të ngjashme. j Histogramet e frekuencës së orientimit të planit të ndarjes qelizore të IPR rreth P3 (jeshile e çelët), P4 (jeshile mesatare) dhe P5 (jeshile e errët), përkatësisht. Vlerat P u morën nga një test Kolmogorov-Smirnov me dy bishta. Eksperimenti u përsërit dy herë me rezultate të ngjashme.
Prandaj, ne më pas hetuam korrelacionin midis sinjalizimit GA dhe aktivitetit të ndarjes qelizore duke identifikuar muret qelizore të sapoformuara gjatë analizës (Fig. 5e). Kjo qasje na lejoi të matnim frekuencën dhe drejtimin e ndarjes qelizore. Çuditërisht, zbuluam se frekuenca e ndarjeve qelizore në IPR dhe pjesën tjetër të SAM (jo-IPR, Fig. 5f) ishte e ngjashme, duke treguar se ndryshimet në sinjalizimin GA midis qelizave IPR dhe jo-IPR nuk ndikojnë ndjeshëm në ndarjen qelizore. Kjo, dhe korrelacioni pozitiv midis sinjalizimit GA dhe anizotropisë së rritjes, na shtyu të shqyrtonim nëse aktiviteti i sinjalizimit GA mund të ndikonte në orientimin e planit të ndarjes qelizore. Ne matëm orientimin e murit të ri qelizor si një kënd akut në lidhje me boshtin radial që lidh qendrën e meristemit dhe qendrën e murit të ri qelizor (Fig. 5e-i) dhe vumë re një tendencë të qartë që qelizat të ndahen në kënde afër 90° në lidhje me boshtin radial, me frekuencat më të larta të vëzhguara në 70-80° (23.28%) dhe 80-90° (22.62%) (Fig. 5e,i), që korrespondojnë me ndarjet qelizore në drejtimin rrethor/tërthor (Fig. 5h). Për të shqyrtuar kontributin e sinjalizimit GA në këtë sjellje të ndarjes qelizore, ne analizuam parametrat e ndarjes qelizore në IPR dhe jo-IPR veçmas (Fig. 5i). Ne vumë re se shpërndarja e këndit të ndarjes në qelizat IPR ndryshonte nga ajo në qelizat jo-IPR ose në qelizat në të gjithë SAM, me qelizat IPR që shfaqnin një përqindje më të lartë të ndarjeve qelizore anësore/rrethore, dmth., 70-80° dhe 80-90° (33.86% dhe 30.71%, përkatësisht, proporcione përkatëse) (Fig. 5i). Kështu, vëzhgimet tona zbuluan një lidhje midis sinjalizimit të lartë GA dhe një orientimi të planit të ndarjes qelizore afër drejtimit rrethor, të ngjashëm me korrelacionin midis aktivitetit të sinjalizimit GA dhe anizotropisë së rritjes (Fig. 5c, d). Për të përcaktuar më tej ruajtjen hapësinore të kësaj lidhjeje, ne matëm orientimin e planit të ndarjes në qelizat IPR që rrethojnë primordiumin duke filluar nga P3, pasi aktiviteti më i lartë i sinjalizimit GA u zbulua në këtë rajon duke filluar nga P4 (Fig. 4). Këndet e ndarjes së IPR rreth P3 dhe P4 nuk treguan ndryshime statistikisht të rëndësishme, megjithëse një frekuencë e rritur e ndarjeve qelizore anësore u vu re në IPR rreth P4 (Fig. 5j). Megjithatë, në qelizat IPR rreth P5, ndryshimi në orientimin e planit të ndarjes qelizore u bë statistikisht i rëndësishëm, me një rritje të ndjeshme të frekuencës së ndarjeve tërthore qelizore (Fig. 5j). Së bashku, këto rezultate sugjerojnë që sinjalizimi GA mund të kontrollojë orientimin e ndarjeve qelizore në SAM, gjë që është në përputhje me raportet e mëparshme40,41 që sinjalizimi i lartë GA mund të shkaktojë orientim anësor të ndarjeve qelizore në IPR.
Parashikohet që qelizat në IPR nuk do të përfshihen në primordia, por në internode2,42,43. Orientimi tërthor i ndarjeve qelizore në IPR mund të rezultojë në organizimin tipik të rreshtave gjatësore paralele të qelizave epidermale në internode. Vëzhgimet tona të përshkruara më sipër sugjerojnë që sinjalizimi GA ka të ngjarë të luajë një rol në këtë proces duke rregulluar drejtimin e ndarjes qelizore.
Humbja e funksionit të disa gjeneve DELLA rezulton në një përgjigje konstitutive GA, dhe mutantët della mund të përdoren për të testuar këtë hipotezë44. Së pari analizuam modelet e shprehjes së pesë gjeneve DELLA në SAM. Bashkimi transkriptues i linjës GUS45 zbuloi se GAI, RGA, RGL1 dhe RGL2 (në një masë shumë më të vogël) u shprehën në SAM (Fig. Plotësuese 11a-d). Hibridizimi in situ tregoi më tej se ARNi i GAI grumbullohet posaçërisht në primordia dhe lule në zhvillim (Fig. Plotësuese 11e). ARNi i RGL1 dhe RGL3 u zbuluan në të gjithë kurorën e SAM dhe në lulet më të vjetra, ndërsa ARNi i RGL2 ishte më i bollshëm në rajonin kufitar (Fig. Plotësuese 11f-h). Imazhet konfokale të pRGL3::RGL3-GFP SAM konfirmuan shprehjen e vëzhguar nga hibridizimi in situ dhe treguan se proteina RGL3 grumbullohet në pjesën qendrore të SAM (Fig. Plotësuese 11i). Duke përdorur linjën pRGA::GFP-RGA, zbuluam gjithashtu se proteina RGA grumbullohet në SAM, por bollëku i saj zvogëlohet në kufi duke filluar nga P4 (Fig. 11j plotësuese). Veçanërisht, modelet e shprehjes së RGL3 dhe RGA janë në përputhje me aktivitetin më të lartë të sinjalizimit GA në IPR, siç zbulohet nga qmRGA (Fig. 4). Për më tepër, këto të dhëna tregojnë se të gjitha DELLA-të shprehen në SAM dhe se shprehja e tyre përfshin së bashku të gjithë SAM-in.
Më pas analizuam parametrat e ndarjes qelizore në SAM të tipit të egër (Ler, kontroll) dhe mutantët gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della pesëfish (global) (Fig. 6a, b). Është interesante se vumë re një ndryshim statistikisht të rëndësishëm në shpërndarjen e frekuencave të këndit të ndarjes qelizore në SAM të mutantit della global krahasuar me tipin e egër (Fig. 6c). Ky ndryshim në mutantin della global ishte për shkak të një rritjeje në frekuencën e këndeve 80-90° (34.71% kundrejt 24.55%) dhe, në një masë më të vogël, këndeve 70-80° (23.78% kundrejt 20.18%), dmth., që korrespondojnë me ndarjet qelizore transversale (Fig. 6c). Frekuenca e ndarjeve jo-transversale (0-60°) ishte gjithashtu më e ulët në mutantin della global (Fig. 6c). Frekuenca e ndarjeve tërthore të qelizave u rrit ndjeshëm në SAM të mutantit della global (Fig. 6b). Frekuenca e ndarjeve tërthore të qelizave në IPR ishte gjithashtu më e lartë në mutantin della global krahasuar me llojin e egër (Fig. 6d). Jashtë rajonit IPR, lloji i egër kishte një shpërndarje më uniforme të këndeve të ndarjes qelizore, ndërsa mutanti della global preferonte ndarjet tangjenciale si IPR (Fig. 6e). Ne gjithashtu përcaktuam orientimin e ndarjeve qelizore në SAM të mutantëve të pesëfishtë të ga2 oksidazës (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 dhe ga2ox6-2), një sfond mutant joaktiv ndaj GA në të cilin grumbullohet GA. Në përputhje me rritjen e niveleve të GA, SAM e inflorescencës së pesëfishtë të mutantit ga2ox ishte më e madhe se ajo e Col-0 (Fig. Plotësuese 12a, b), dhe krahasuar me Col-0, SAM e pesëfishtë ga2ox tregoi një shpërndarje dukshëm të ndryshme të këndeve të ndarjes qelizore, me frekuencën e këndit që rritet nga 50° në 90°, pra përsëri duke favorizuar ndarjet tangjenciale (Fig. Plotësuese 12a–c). Kështu, ne tregojmë se aktivizimi konstitutiv i sinjalizimit GA dhe akumulimi i GA shkaktojnë ndarje anësore qelizore në IPR dhe pjesën tjetër të SAM.
a, b Vizualizimi 3D i shtresës L1 të Ler (a) të ngjyrosur me PI dhe mutantit global della (b) SAM duke përdorur mikroskopi konfokale. Muret e reja qelizore të formuara në SAM (por jo në primordium) gjatë një periudhe 10-orëshe tregohen dhe ngjyrosen sipas vlerave të tyre të këndit. Figura e brendshme tregon SAM në 0 orë. Shiriti i ngjyrave shfaqet në këndin e poshtëm të djathtë. Shigjeta në (b) tregon një shembull të skedarëve qelizorë të rreshtuar në mutantin global della. Eksperimenti u përsërit dy herë me rezultate të ngjashme. ce krahasim i shpërndarjes së frekuencës së orientimeve të planit të ndarjes qelizore në të gjithë SAM (d), IPR (e) dhe jo-IPR (f) midis Ler dhe della globale. Vlerat P u morën duke përdorur një test Kolmogorov-Smirnov me dy bishta. f, g Vizualizimi 3D i imazheve konfokale të SAM të ngjyrosur me PI të bimëve transgjenike Col-0 (i) dhe pCUC2::gai-1-VENUS (j). Panelet (a, b) tregojnë mure të reja qelizore (por jo primordia) të formuara në SAM brenda 10 orëve. Eksperimenti u përsërit dy herë me rezultate të ngjashme. h–j Krahasimi i shpërndarjes së frekuencave të orientimeve të planit të ndarjes qelizore të vendosura në të gjithë SAM (h), IPR (i) dhe jo-IPR (j) midis bimëve Col-0 dhe pCUC2::gai-1-VENUS. Vlerat P u morën duke përdorur një test Kolmogorov-Smirnov me dy bishta.
Më pas testuam efektin e frenimit të sinjalizimit GA në mënyrë specifike në IPR. Për këtë qëllim, përdorëm promotorin e kupës 2 të kotiledonit (CUC2) për të nxitur shprehjen e një proteine dominante negative gai-1 të shkrirë me VENUS (në linjën pCUC2::gai-1-VENUS). Në SAM të tipit të egër, promotori CUC2 nxit shprehjen e shumicës së IPR-ve në SAM, duke përfshirë qelizat kufitare, nga P4 e tutje, dhe shprehje e ngjashme specifike u vu re në bimët pCUC2::gai-1-VENUS (shih më poshtë). Shpërndarja e këndeve të ndarjes qelizore përgjatë SAM ose IPR të bimëve pCUC2::gai-1-VENUS nuk ishte dukshëm e ndryshme nga ajo e tipit të egër, megjithëse papritur zbuluam se qelizat pa një IPR në këto bimë ndaheshin në një frekuencë më të lartë prej 80-90° (Fig. 6f-j).
Është sugjeruar që drejtimi i ndarjes qelizore varet nga gjeometria e SAM, në veçanti stresi në tërheqje i gjeneruar nga lakimi i indeve46. Prandaj, ne pyetëm nëse forma e SAM ishte ndryshuar në bimët mutante della global dhe pCUC2::gai-1-VENUS. Siç është raportuar më parë12, madhësia e SAM mutante della global ishte më e madhe se ajo e llojit të egër (Fig. plotësuese 13a, b, d). Hibridizimi in situ i ARN-së CLV3 dhe STM konfirmoi zgjerimin e meristemit në mutantët della dhe tregoi më tej zgjerimin anësor të vendndodhjes së qelizave staminale (Fig. plotësuese 13e, f, h, i). Megjithatë, lakimi i SAM ishte i ngjashëm në të dy gjenotipet (Fig. plotësuese 13k, m, n, p). Ne vumë re një rritje të ngjashme në madhësi në mutantin katërfish gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della pa një ndryshim në lakim krahasuar me llojin e egër (Fig. Plotësuese 13c, d, g, j, l, o, p). Frekuenca e orientimit të ndarjes qelizore u ndikua gjithashtu në mutantin katërfish della, por në një masë më të vogël sesa në mutantin monolit della (Fig. Plotësuese 12d-f). Ky efekt dozimi, së bashku me mungesën e një efekti në lakim, sugjeron që aktiviteti i mbetur i RGL3 në mutantin katërfish Della kufizon ndryshimet në orientimin e ndarjes qelizore të shkaktuara nga humbja e aktivitetit DELLA dhe se ndryshimet në ndarjet anësore qelizore ndodhin në përgjigje të ndryshimeve në aktivitetin e sinjalizimit GA në vend të ndryshimeve në gjeometrinë SAM. Siç përshkruhet më sipër, promotori CUC2 nxit shprehjen IPR në SAM duke filluar në P4 (Fig. Plotësuese 14a, b), dhe në të kundërt, SAM pCUC2::gai-1-VENUS kishte një madhësi të reduktuar por lakim më të lartë (Fig. Plotësuese 14c-h). Ky ndryshim në morfologjinë e pCUC2::gai-1-VENUS SAM mund të rezultojë në një shpërndarje të ndryshme të streseve mekanike krahasuar me llojin e egër, në të cilin streset e larta rrethore fillojnë në një distancë më të shkurtër nga qendra e SAM47. Nga ana tjetër, ndryshimet në morfologjinë e pCUC2::gai-1-VENUS SAM mund të vijnë nga ndryshimet në vetitë mekanike rajonale të shkaktuara nga shprehja e transgjeneve48. Në të dyja rastet, kjo mund të kompensojë pjesërisht efektet e ndryshimeve në sinjalizimin GA duke rritur gjasat që qelizat të ndahen në orientimin rrethor/tërthor, duke shpjeguar vëzhgimet tona.
Të marra së bashku, të dhënat tona konfirmojnë se sinjalizimi më i lartë GA luan një rol aktiv në orientimin anësor të planit të ndarjes qelizore në IPR. Ato gjithashtu tregojnë se lakimi i meristemit ndikon gjithashtu në orientimin e planit të ndarjes qelizore në IPR.
Orientimi tërthor i planit të ndarjes në IPR, për shkak të aktivitetit të lartë të sinjalizimit GA, sugjeron që GA paraprakisht organizon një skedar qelizor radial në epidermë brenda SAM për të përcaktuar organizimin qelizor që më vonë do të gjendet në internodin epidermal. Në të vërtetë, skedarë të tillë qelizash ishin shpesh të dukshëm në imazhet SAM të mutantëve della global (Fig. 6b). Kështu, për të eksploruar më tej funksionin zhvillimor të modelit hapësinor të sinjalizimit GA në SAM, ne përdorëm imazhe me interval kohor për të analizuar organizimin hapësinor të qelizave në IPR në bimët transgjenike të tipit të egër (Ler dhe Col-0), mutantët della global dhe bimët transgjenike pCUC2::gai-1-VENUS.
Ne zbuluam se qmRGA tregoi se aktiviteti i sinjalizimit GA në IPR u rrit nga P1/P2 dhe arriti kulmin në P4, dhe ky model mbeti konstant me kalimin e kohës (Fig. 4a–f dhe Fig. Plotësuese 8c–f, k). Për të analizuar organizimin hapësinor të qelizave në IPR me sinjalin GA në rritje, ne etiketuam qelizat Ler IPR sipër dhe në anët e P4 sipas fatit të tyre zhvillimor të analizuar 34 orë pas vëzhgimit të parë, dmth., më shumë se dy herë plastide, duke na lejuar të ndjekim qelizat IPR gjatë zhvillimit të primordiumit nga P1/P2 në P4. Ne përdorëm tre ngjyra të ndryshme: të verdhë për ato qeliza që u integruan në primordium pranë P4, jeshile për ato që ishin në IPR dhe vjollcë për ato që morën pjesë në të dy proceset (Fig. 7a–c). Në t0 (0 h), 1-2 shtresa të qelizave IPR ishin të dukshme përpara P4 (Fig. 7a). Siç pritej, kur këto qeliza u ndanë, ato e bënë këtë kryesisht nëpërmjet planit të ndarjes tërthore (Fig. 7a–c). Rezultate të ngjashme u morën duke përdorur Col-0 SAM (duke u përqendruar në P3, kufiri i të cilit paloset në mënyrë të ngjashme me P4 në Ler), megjithëse në këtë gjenotip palosja e formuar në kufirin lulor i fshehu qelizat IPR më shpejt (Fig. 7g–i). Kështu, modeli i ndarjes së qelizave IPR i paraorganizon qelizat në rreshta radiale, si në internoda. Organizimi i rreshtave radiale dhe lokalizimi i qelizave IPR midis organeve të njëpasnjëshme sugjerojnë që këto qeliza janë paraardhëse internodale.
Këtu, ne zhvilluam një biosensor ratiometrik të sinjalizimit GA, qmRGA, që lejon hartëzimin sasior të aktivitetit të sinjalizimit GA që rezulton nga përqendrimet e kombinuara të GA dhe receptorëve GA, duke minimizuar ndërhyrjen me rrugët endogjene të sinjalizimit, duke ofruar kështu informacion mbi funksionin e GA në nivel qelizor. Për këtë qëllim, ne ndërtuam një proteinë të modifikuar DELLA, mRGA, që ka humbur aftësinë për t'u lidhur me partnerët e ndërveprimit DELLA, por mbetet e ndjeshme ndaj proteolizës së induktuar nga GA. qmRGA i përgjigjet ndryshimeve si ekzogjene ashtu edhe endogjene në nivelet e GA, dhe vetitë e saj dinamike të ndjeshmërisë mundësojnë vlerësimin e ndryshimeve hapësinore-kohore në aktivitetin e sinjalizimit GA gjatë zhvillimit. qmRGA është gjithashtu një mjet shumë fleksibël pasi mund të përshtatet në inde të ndryshme duke ndryshuar promotorin e përdorur për shprehjen e tij (nëse është e nevojshme), dhe duke pasur parasysh natyrën e konservuar të rrugës së sinjalizimit GA dhe motivin PFYRE nëpër angiosperma, ka të ngjarë të jetë e transferueshme në specie të tjera22. Në përputhje me këtë, një mutacion ekuivalent në proteinën SLR1 DELLA të orizit (HYY497AAA) u tregua gjithashtu se shtyp aktivitetin e represorit të rritjes së SLR1, ndërsa zvogëlon vetëm pak degradimin e saj të ndërmjetësuar nga GA, ngjashëm me mRGA23. Veçanërisht, studimet e fundit në Arabidopsis treguan se një mutacion i vetëm aminoacidi në domenin PFYRE (S474L) ndryshoi aktivitetin transkriptues të RGA pa ndikuar në aftësinë e tij për të bashkëvepruar me partnerët e faktorit të transkriptimit50. Edhe pse ky mutacion është shumë afër 3 zëvendësimeve të aminoacideve të pranishme në mRGA, studimet tona tregojnë se këto dy mutacione ndryshojnë karakteristikat e dallueshme të DELLA. Edhe pse shumica e partnerëve të faktorit të transkriptimit lidhen me domenet LHR1 dhe SAW të DELLA26,51, disa aminoacide të konservuara në domenin PFYRE mund të ndihmojnë në stabilizimin e këtyre bashkëveprimeve.
Zhvillimi i internodës është një tipar kyç në arkitekturën e bimëve dhe përmirësimin e rendimentit. qmRGA zbuloi aktivitet më të lartë të sinjalizimit GA në qelizat paraardhëse të internodës IPR. Duke kombinuar imazherinë sasiore dhe gjenetikën, ne treguam se modelet e sinjalizimit GA mbivendosin planet e ndarjes qelizore rrethore/tërthor në epidermën SAM, duke formësuar organizimin e ndarjes qelizore të nevojshme për zhvillimin e internodës. Disa rregullatorë të orientimit të planit të ndarjes qelizore janë identifikuar gjatë zhvillimit52,53. Puna jonë ofron një shembull të qartë se si aktiviteti i sinjalizimit GA rregullon këtë parametër qelizor. DELLA mund të bashkëveprojë me komplekset e proteinave parapalosëse41, kështu që sinjalizimi GA mund të rregullojë orientimin e planit të ndarjes qelizore duke ndikuar drejtpërdrejt në orientimin e mikrotubulave kortikale40,41,54,55. Ne treguam papritur se në SAM, korrelacioni i aktivitetit më të lartë të sinjalizimit GA nuk ishte zgjatja ose ndarja e qelizave, por vetëm anizotropia e rritjes, e cila është në përputhje me një efekt të drejtpërdrejtë të GA në drejtimin e ndarjes qelizore në IPR. Megjithatë, nuk mund ta përjashtojmë që ky efekt mund të jetë edhe i tërthortë, për shembull i ndërmjetësuar nga zbutja e murit qelizor të shkaktuar nga GA56. Ndryshimet në vetitë e murit qelizor shkaktojnë stres mekanik57,58, i cili gjithashtu mund të ndikojë në orientimin e planit të ndarjes qelizore duke ndikuar në orientimin e mikrotubulave kortikale39,46,59. Efektet e kombinuara të stresit mekanik të shkaktuar nga GA dhe rregullimit të drejtpërdrejtë të orientimit të mikrotubulave nga GA mund të përfshihen në gjenerimin e një modeli specifik të orientimit të ndarjes qelizore në IPR për të përcaktuar internodet, dhe nevojiten studime të mëtejshme për të testuar këtë ide. Në mënyrë të ngjashme, studimet e mëparshme kanë theksuar rëndësinë e proteinave TCP14 dhe 15 që bashkëveprojnë me DELLA në kontrollin e formimit të internodës60,61 dhe këta faktorë mund të ndërmjetësojnë veprimin e GA së bashku me BREVIPEDICELLUS (BP) dhe PENNYWISE (PNY), të cilat rregullojnë zhvillimin e internodës dhe janë treguar se ndikojnë në sinjalizimin GA2,62. Duke pasur parasysh që DELLA-të bashkëveprojnë me rrugët e sinjalizimit të brassinosteroideve, etilenit, acidit jasmonik dhe acidit abscisik (ABA)63,64 dhe se këto hormone mund të ndikojnë në orientimin e mikrotubulave65, efektet e GA-së në orientimin e ndarjes qelizore mund të ndërmjetësohen edhe nga hormone të tjera.
Studimet e hershme citologjike treguan se si rajonet e brendshme ashtu edhe ato të jashtme të SAM të Arabidopsis janë të nevojshme për zhvillimin e internodës2,42. Fakti që GA rregullon në mënyrë aktive ndarjen qelizore në indet e brendshme12 mbështet një funksion të dyfishtë të GA në rregullimin e meristemit dhe madhësisë së internodës në SAM. Modeli i ndarjes së drejtuar të qelizave është gjithashtu i rregulluar fort në indin e brendshëm SAM, dhe ky rregullim është thelbësor për rritjen e kërcellit52. Do të jetë interesante të shqyrtohet nëse GA luan gjithashtu një rol në orientimin e planit të ndarjes qelizore në organizimin e brendshëm SAM, duke sinkronizuar kështu specifikimin dhe zhvillimin e internodave brenda SAM.
Bimët u rritën in vitro në tokë ose 1x medium Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) të plotësuar me 1% sukrozë dhe 1% agar (Sigma) në kushte standarde (16 orë dritë, 22 °C), përveç eksperimenteve të hipokotilit dhe rritjes së rrënjëve në të cilat fidanët u rritën në pllaka vertikale nën dritë konstante dhe 22 °C. Për eksperimentet e nitratit, bimët u rritën në medium të modifikuar MS (medium bimor bioWORLD) të plotësuar me nitrat të mjaftueshëm (0 ose 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-suksinat, 1% sukrozë dhe 1% A-agar (Sigma) në kushte dite të gjata.
ADNc-ja e GID1a e futur në pDONR221 u rikombinua me pDONR P4-P1R-pUBQ10 dhe pDONR P2R-P3-mCherry në pB7m34GW për të gjeneruar pUBQ10::GID1a-mCherry. ADN-ja IDD2 e futur në pDONR221 u rikombinua në pB7RWG266 për të gjeneruar p35S:IDD2-RFP. Për të gjeneruar pGID1b::2xmTQ2-GID1b, një fragment 3.9 kb në rrjedhën e sipërme të rajonit kodues GID1b dhe një fragment 4.7 kb që përmban ADNc-në GID1b (1.3 kb) dhe terminatorin (3.4 kb) u amplifikuan fillimisht duke përdorur prajmerët në Tabelën Plotësuese 3 dhe më pas u futën në pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) dhe pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), përkatësisht, dhe së fundmi u rikombinuan me pDONR221 2xmTQ268 në vektorin e synuar pGreen 012567 duke përdorur klonimin Gateway. Për të gjeneruar pCUC2::LSSmOrange, sekuenca e promotorit CUC2 (3229 bp në rrjedhën e sipërme të ATG) e ndjekur nga sekuenca koduese e mOrange të zhvendosur nga Stokes (LSSmOrange)69 të madh me sinjalin e lokalizimit bërthamor N7 dhe terminatori transkriptues NOS u mblodhën në vektorin e synimit të kanamicinës pGreen duke përdorur sistemin e rekombinimit të fragmentit Gateway 3 (Invitrogen). Vektori binar i bimës u fut në llojin GV3101 të Agrobacterium tumefaciens dhe u fut në gjethet e Nicotiana benthamiana me metodën e infiltrimit të Agrobacterium dhe në Arabidopsis thaliana Col-0 me metodën e zhytjes florale, përkatësisht. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry dhe pCLV3::mCherry-NLS qmRGA u izoluan nga pasardhësit F3 dhe F1 të kryqëzimeve përkatëse, përkatësisht.
Hibridizimi i ARN-së in situ u krye në maja të lastarëve me gjatësi afërsisht 1 cm72, të cilat u mblodhën dhe u fiksuan menjëherë në tretësirë FAA (3.7% formaldehid, 5% acid acetik, 50% etanol) të paraftohura në 4 °C. Pas 2 trajtimeve me vakum prej 15 minutash, fiksuesi u ndryshua dhe mostrat u inkubuan gjatë natës. ADNc-të GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 dhe RGL3 dhe sondat antisens për 3′-UTR-të e tyre u sintetizuan duke përdorur prajmerët e treguar në Tabelën Plotësuese 3 siç përshkruhet nga Rosier et al.73. Sondat e shënuara me digoksigeninë u imunodetektuan duke përdorur antitrupa të digoksigeninës (hollim 3000-fish; Roche, numri i katalogut: 11 093 274 910), dhe seksionet u ngjyrosën me tretësirë 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat (BCIP, hollim 250-fish)/nitroblue tetrazolium (NBT, hollim 200-fish).
Koha e postimit: 10 shkurt 2025