Rritja e meristemit apikal të kërcellit (SAM) është kritike për arkitekturën e kërcellit. Hormonet bimoregiberelinë(GA) luajnë role kyçe në koordinimin e rritjes së bimëve, por roli i tyre në SAM mbetet i kuptuar keq. Këtu, ne zhvilluam një biosensor ratiometrik të sinjalizimit GA duke inxhinieruar proteinën DELLA për të shtypur funksionin e saj thelbësor rregullator në përgjigjen transkriptuese GA duke ruajtur degradimin e tij pas njohjes së GA. Ne demonstrojmë se ky biosensor i bazuar në degradim regjistron me saktësi ndryshimet në nivelet e GA dhe ndjeshmërinë qelizore gjatë zhvillimit. Ne përdorëm këtë biosensor për të hartuar aktivitetin e sinjalizimit GA në SAM. Ne tregojmë se sinjalet e larta GA janë të pranishme kryesisht në qelizat e vendosura midis primordiave të organeve, të cilat janë pararendëse të qelizave internode. Duke përdorur qasjet e fitimit dhe humbjes së funksionit, ne demonstrojmë më tej se GA rregullon orientimin e planit të ndarjes së qelizave, duke vendosur organizimin kanonik qelizor të ndërnyjeve, duke promovuar në këtë mënyrë specifikimin e ndërnyjeve në SAM.
Meristemi apikal i lastarëve (SAM), i vendosur në majën e lastarëve, përmban një kamare qelizash burimore, aktiviteti i të cilave gjeneron organe anësore dhe nyje burimore në një mënyrë modulare dhe përsëritëse gjatë gjithë jetës së bimës. Secila nga këto njësi përsëritëse, ose nyje bimore, përfshin ndërnyjet dhe organet anësore në nyjet, dhe meristemet sqetullore në sqetullat e gjetheve1. Rritja dhe organizimi i nyjeve të bimëve ndryshon gjatë zhvillimit. Në Arabidopsis, rritja ndërnyjore është e shtypur gjatë fazës vegjetative dhe meristemet sqetullore mbeten të fjetura në sqetullat e gjetheve të rozetës. Gjatë kalimit në fazën e lules, SAM bëhet meristem i tufë lulesh, duke gjeneruar ndërnyje të zgjatura dhe sytha sqetullore, degëza në sqetullat e gjetheve të kaulinës dhe më vonë, lule pa gjethe2. Megjithëse kemi bërë përparim të rëndësishëm në kuptimin e mekanizmave që kontrollojnë fillimin e gjetheve, luleve dhe degëve, dihet relativisht pak se si lindin ndërnyjat.
Kuptimi i shpërndarjes hapësinore-kohore të GA do të ndihmojë për të kuptuar më mirë funksionet e këtyre hormoneve në inde të ndryshme dhe në faza të ndryshme zhvillimi. Vizualizimi i degradimit të shkrirjes RGA-GFP i shprehur nën veprimin e promotorit të vet jep informacion të rëndësishëm mbi rregullimin e niveleve totale të GA në rrënjë15,16. Megjithatë, shprehja e RGA ndryshon nëpër inde17 dhe rregullohet nga GA18. Kështu, shprehja diferenciale e promotorit RGA mund të rezultojë në modelin e fluoreshencës të vëzhguar me RGA-GFP dhe kështu kjo metodë nuk është sasiore. Kohët e fundit, GA19,20 e etiketuar me fluorescein bioaktive (Fl) zbuloi akumulimin e GA në endokorteksin rrënjë dhe rregullimin e niveleve të tij qelizore nga transporti GA. Kohët e fundit, sensori GA FRET nlsGPS1 tregoi se nivelet e GA lidhen me zgjatjen e qelizave në rrënjë, filamente dhe hipokotilë të rritur në errësirë21. Megjithatë, siç e kemi parë, përqendrimi i GA nuk është i vetmi parametër që kontrollon aktivitetin e sinjalizimit të GA, pasi varet nga proceset komplekse të sensorit. Këtu, duke u mbështetur në të kuptuarit tonë për rrugët e sinjalizimit DELLA dhe GA, ne raportojmë zhvillimin dhe karakterizimin e një biosensori ratiometrik të bazuar në degradim për sinjalizimin GA. Për të zhvilluar këtë biosensor sasior, ne përdorëm një RGA mutant të ndjeshme ndaj GA që ishte shkrirë me një proteinë fluoreshente dhe e shprehur kudo në inde, si dhe një proteinë fluoreshente e pandjeshme ndaj GA. Ne tregojmë se bashkimet mutant të proteinave RGA nuk ndërhyjnë në sinjalizimin endogjen GA kur shprehen kudo, dhe se ky biosensor mund të përcaktojë sasinë e aktivitetit të sinjalizimit që rezulton si nga hyrja GA ashtu edhe nga përpunimi i sinjalit GA nga aparati ndijor me rezolucion të lartë hapësinor-kohor. Ne përdorëm këtë biosensor për të hartuar shpërndarjen hapësinore-kohore të aktivitetit të sinjalizimit GA dhe për të përcaktuar sasinë se si GA rregullon sjelljen qelizore në epidermën SAM. Ne demonstrojmë se GA rregullon orientimin e rrafshit të ndarjes së qelizave SAM të vendosura midis primordiave të organit, duke përcaktuar kështu organizimin kanonik qelizor të internodit.
Së fundi, ne pyetëm nëse qmRGA mund të raportonte ndryshime në nivelet endogjene të GA duke përdorur hipokotilet në rritje. Ne treguam më parë se nitrati stimulon rritjen duke rritur sintezën e GA dhe, nga ana tjetër, degradimin e DELLA34. Prandaj, ne vumë re se gjatësia e hipokotilit në pUBQ10:: qmRGA fidane të rritura nën furnizim të bollshëm nitrat (10 mM NO3-) ishte dukshëm më e gjatë se ajo në fidanët e rritur në kushte me mungesë nitratesh (Figura plotësuese 6a). Në përputhje me përgjigjen e rritjes, sinjalet GA ishin më të larta në hipokotilet e fidanëve të rritur nën kushte 10 mM NO3- sesa në fidanët e rritur në mungesë të nitratit (Figura plotësuese 6b, c). Kështu, qmRGA gjithashtu mundëson monitorimin e ndryshimeve në sinjalizimin GA të shkaktuara nga ndryshimet endogjene në përqendrimin e GA.
Për të kuptuar nëse aktiviteti i sinjalizimit GA i zbuluar nga qmRGA varet nga përqendrimi i GA dhe perceptimi i GA, siç pritej bazuar në modelin e sensorit, ne analizuam shprehjen e tre receptorëve GID1 në indet vegjetative dhe riprodhuese. Në fidanë, linja raportuese GID1-GUS tregoi se GID1a dhe c ishin shumë të shprehura në kotiledone (Fig. 3a-c). Përveç kësaj, të tre receptorët u shprehën në gjethe, primordia anësore të rrënjëve, majat e rrënjëve (përveç kapakut të rrënjës së GID1b) dhe sistemin vaskular (Fig. 3a-c). Në tufë lulesh SAM, ne zbuluam sinjale GUS vetëm për GID1b dhe 1c (Figura plotësuese 7a-c). Hibridizimi në vend konfirmoi këto modele shprehjeje dhe tregoi më tej se GID1c u shpreh në mënyrë uniforme në nivele të ulëta në SAM, ndërsa GID1b tregoi shprehje më të lartë në periferi të SAM (Figura plotësuese 7d-l). Fuzioni përkthimor pGID1b:: 2xmTQ2-GID1b zbuloi gjithashtu një gamë të shkallëzuar të shprehjes GID1b, nga shprehja e ulët ose aspak në qendër të SAM deri tek shprehja e lartë në kufijtë e organeve (Figura plotësuese 7m). Kështu, receptorët GID1 nuk shpërndahen në mënyrë uniforme nëpër dhe brenda indeve. Në eksperimentet e mëvonshme, ne vërejtëm gjithashtu se mbishprehja e GID1 (pUBQ10:: GID1a-mCherry) rriti ndjeshmërinë e qmRGA në hipokotilet ndaj aplikimit të jashtëm të GA (Fig. 3d, e). Në të kundërt, fluoreshenca e matur me qd17mRGA në hipokotil ishte e pandjeshme ndaj trajtimit GA3 (Fig. 3f, g). Për të dyja analizat, fidanët u trajtuan me përqendrime të larta të GA (100 μM GA3) për të vlerësuar sjelljen e shpejtë të sensorit, ku aftësia për t'u lidhur me receptorin GID1 u rrit ose humbi. Së bashku, këto rezultate konfirmojnë se biosensori qmRGA shërben një funksion të kombinuar si sensor GA dhe GA dhe sugjerojnë që shprehja diferenciale e receptorit GID1 mund të modulojë ndjeshëm emetimin e sensorit.
Deri më sot, shpërndarja e sinjaleve GA në SAM mbetet e paqartë. Prandaj, ne përdorëm bimët që shprehin qmRGA dhe raportuesin e qelizave staminale pCLV3::mCherry-NLS35 për të llogaritur hartat sasiore me rezolucion të lartë të aktivitetit të sinjalizimit GA, duke u fokusuar në shtresën L1 (epidermë; Fig. 4a, b, shih Metodat dhe Metodat Suplementare të rritjes a. Këtu, shprehja pCLV3:: mCherry-NLS siguroi një pikë referimi gjeometrike fikse për analizimin e shpërndarjes hapësinore-kohore të aktivitetit të sinjalizimit GA37. Megjithëse GA konsiderohet thelbësore për zhvillimin e organeve anësore4, ne vumë re se sinjalet GA ishin të ulëta në primordiumin floral (P) duke filluar nga faza P3 (Fig. 4a, b), ndërsa primordiumet e rinj P1 dhe P2 kishin aktivitet të moderuar të ngjashëm me atë në rajonin qendror (Fig. 4a, b). Aktiviteti më i lartë i sinjalizimit të GA u zbulua në kufijtë e organit primordium, duke filluar nga P1/P2 (në anët e kufirit) dhe duke arritur kulmin në P4, si dhe në të gjitha qelizat e rajonit periferik të vendosur midis primordieve (Fig. 4a, b dhe Fig. Suplementare 8a, b). Ky aktivitet më i lartë sinjalizues GA u vu re jo vetëm në epidermë, por edhe në shtresat L2 dhe L3 të sipërme (Fig. Suplementare 8b). Modeli i sinjaleve GA të zbuluara në SAM duke përdorur qmRGA gjithashtu mbeti i pandryshuar me kalimin e kohës (Figura plotësuese 8c-f, k). Megjithëse konstrukti qd17mRGA u rregullua sistematikisht në SAM të impianteve T3 nga pesë linja të pavarura që i karakterizuam në detaje, ne ishim në gjendje të analizonim modelet e fluoreshencës të marra me konstruktin pRPS5a:: VENUS-2A-TagBFP (Figura plotësuese 8g-j, l). Në këtë linjë kontrolli, vetëm ndryshime të vogla në raportin e fluoreshencës u zbuluan në SAM, por në qendrën SAM ne vumë re një rënie të qartë dhe të papritur në VENUS të lidhur me TagBFP. Kjo konfirmon se modeli i sinjalizimit i vëzhguar nga qmRGA pasqyron degradimin e varur nga GA të mRGA-VENUS, por gjithashtu tregon se qmRGA mund të mbivlerësojë aktivitetin e sinjalizimit GA në qendrën e meristemit. Në përmbledhje, rezultatet tona zbulojnë një model sinjalizimi GA që pasqyron kryesisht shpërndarjen e primordia. Kjo shpërndarje e rajonit ndër-primordial (IPR) është për shkak të vendosjes graduale të aktivitetit të lartë sinjalizues GA midis primordiumit në zhvillim dhe rajonit qendror, ndërsa në të njëjtën kohë aktiviteti sinjalizues GA në primordium zvogëlohet (Fig. 4c, d).
Shpërndarja e receptorëve GID1b dhe GID1c (shih më lart) sugjeron që shprehja diferenciale e receptorëve GA ndihmon në formimin e modelit të aktivitetit të sinjalizimit GA në SAM. Ne pyetëm nëse mund të përfshihej akumulimi diferencial i GA. Për të hetuar këtë mundësi, ne përdorëm sensorin nlsGPS1 GA FRET21. Rritja e frekuencës së aktivizimit u zbulua në SAM të nlsGPS1 të trajtuar me 10 μM GA4+7 për 100 minuta (Figura plotësuese 9a–e), duke treguar se nlsGPS1 i përgjigjet ndryshimeve në përqendrimin e GA në SAM, ashtu si në rrënjët21. Shpërndarja hapësinore e frekuencës së aktivizimit nlsGPS1 zbuloi nivele relativisht të ulëta GA në shtresat e jashtme të SAM, por tregoi se ato ishin të ngritura në qendër dhe në kufijtë e SAM (Fig. 4e dhe Fig. Suplementare 9a,c). Kjo sugjeron që GA shpërndahet gjithashtu në SAM me një model hapësinor të krahasueshëm me atë të zbuluar nga qmRGA. Si një qasje plotësuese, ne trajtuam gjithashtu SAM me GA fluoreshente (GA3-, GA4-, GA7-Fl) ose vetëm Fl si një kontroll negativ. Sinjali Fl u shpërnda në të gjithë SAM, duke përfshirë rajonin qendror dhe primordiumin, megjithëse me një intensitet më të ulët (Fig. 4j dhe Fig. Suplementar 10d). Në të kundërt, të tre GA-Fl u grumbulluan në mënyrë specifike brenda kufijve primordium dhe në shkallë të ndryshme në pjesën tjetër të IPR, me GA7-Fl të grumbulluar në domenin më të madh në IPR (Fig. 4k dhe Fig. Suplementare 10a,b). Kuantifikimi i intensitetit të fluoreshencës zbuloi se raporti IPR ndaj intensitetit jo-IPR ishte më i lartë në SAM të trajtuar me GA-Fl krahasuar me SAM të trajtuar me Fl (Fig. 4l dhe Fig. suplementare 10c). Së bashku, këto rezultate sugjerojnë se GA është i pranishëm në përqendrime më të larta në qelizat IPR që ndodhen më afër kufirit të organit. Kjo sugjeron që modeli i aktivitetit të sinjalizimit SAM GA rezulton si nga shprehja diferenciale e receptorëve GA ashtu edhe nga akumulimi diferencial i GA në qelizat IPR pranë kufijve të organeve. Kështu, analiza jonë zbuloi një model të papritur hapësinor-kohor të sinjalizimit GA, me aktivitet më të ulët në qendër dhe primordium të SAM dhe aktivitet më të lartë në IPR në rajonin periferik.
Për të kuptuar rolin e aktivitetit diferencial të sinjalizimit GA në SAM, ne analizuam korrelacionin midis aktivitetit të sinjalizimit GA, zgjerimit të qelizave dhe ndarjes së qelizave duke përdorur imazhe në kohë reale të SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Duke pasur parasysh rolin e GA në rregullimin e rritjes, pritej një korrelacion pozitiv me parametrat e zgjerimit të qelizave. Prandaj, ne fillimisht krahasuam hartat e aktivitetit të sinjalizimit të GA me hartat e shkallës së rritjes së sipërfaqes qelizore (si përafrim për forcën e zgjerimit të qelizës për një qelizë të caktuar dhe për qelizat bija në ndarje) dhe me hartat e anizotropisë së rritjes, e cila mat drejtimin e zgjerimit të qelizave (përdoret gjithashtu këtu për një qelizë të caktuar dhe për qelizat bija në ndarje; Fig. Hartat tona të shkallës së rritjes së sipërfaqes së qelizave SAM janë në përputhje me vëzhgimet e mëparshme38,39, me norma minimale rritjeje në kufi dhe norma maksimale të rritjes në lulet në zhvillim (Fig. 5a). Analiza e komponentit kryesor (PCA) tregoi se aktiviteti i sinjalizimit GA ishte i lidhur negativisht me intensitetin e rritjes së sipërfaqes së qelizave (Figura 5c). Ne treguam gjithashtu se akset kryesore të variacionit, duke përfshirë hyrjen e sinjalizimit GA dhe intensitetin e rritjes, ishin ortogonale me drejtimin e përcaktuar nga shprehja e lartë CLV3, duke konfirmuar përjashtimin e qelizave nga qendra SAM në analizat e mbetura. Analiza e korrelacionit Spearman konfirmoi rezultatet e PCA (Figura 5d), duke treguar se sinjalet më të larta GA në IPR nuk rezultuan në zgjerim më të lartë të qelizave. Sidoqoftë, analiza e korrelacionit zbuloi një korrelacion të lehtë pozitiv midis aktivitetit të sinjalizimit GA dhe anizotropisë së rritjes (Figura 5c, d), duke sugjeruar që sinjalizimi më i lartë i GA në IPR ndikon në drejtimin e rritjes së qelizave dhe ndoshta pozicionin e planit të ndarjes së qelizave.
a, b Hartat e nxehtësisë së rritjes mesatare të sipërfaqes (a) dhe anizotropisë së rritjes (b) në SAM mesatarisht mbi shtatë impiante të pavarura (përdorur si përfaqësues për forcën dhe drejtimin e zgjerimit të qelizës, respektivisht). c Analiza PCA përfshinte variablat e mëposhtëm: sinjalin GA, intensitetin e rritjes sipërfaqësore, anizotropinë e rritjes sipërfaqësore dhe shprehjen CLV3. Komponenti 1 PCA ishte kryesisht i lidhur negativisht me intensitetin e rritjes sipërfaqësore dhe i lidhur pozitivisht me sinjalin GA. Komponenti 2 i PCA ishte kryesisht i lidhur pozitivisht me anizotropinë e rritjes sipërfaqësore dhe i lidhur negativisht me shprehjen CLV3. Përqindjet përfaqësojnë variacionin e shpjeguar nga secili komponent. d Analiza e korrelacionit Spearman midis sinjalit GA, intensitetit të rritjes sipërfaqësore dhe anizotropisë së rritjes sipërfaqësore në shkallën e indeve duke përjashtuar CZ. Numri në të djathtë është vlera e Spearman rho midis dy variablave. Yjet tregojnë rastet kur korrelacioni/korrelacioni negativ është shumë domethënës. e Vizualizimi 3D i qelizave Col-0 SAM L1 me mikroskop konfokal. Muret e reja qelizore të formuara në SAM (por jo në primordium) në 10 orë ngjyrosen sipas vlerave të tyre të këndit. Shiriti i ngjyrave shfaqet në këndin e poshtëm djathtas. Futja tregon imazhin përkatës 3D në 0 orë. Eksperimenti u përsërit dy herë me rezultate të ngjashme. f Grafikët e kutive shfaqin normat e ndarjes së qelizave në IPR dhe jo-IPR Col-0 SAM (n = 10 bimë të pavarura). Vija qendrore tregon mesataren, dhe kufijtë e kutisë tregojnë përqindjen e 25-të dhe të 75-të. Mustaqet tregojnë vlerat minimale dhe maksimale të përcaktuara me softuerin R. Vlerat e P-së u morën me testin t-të dyfishtë të Welch. g, h Diagrami skematik që tregon (g) se si të matet këndi i murit të ri qelizor (magenta) në lidhje me drejtimin radial nga qendra e SAM (vijë me pika të bardha) (vetëm vlerat akute të këndit, p.sh., 0–90°, merren parasysh) dhe (h) drejtimet rrethore/anësore dhe radiale brenda meristemit. i Histogramet e frekuencës së orientimit të planit të ndarjes qelizore përgjatë SAM (blu e errët), IPR (blu mesatare) dhe jo-IPR (blu e çelur), respektivisht. Vlerat P u morën nga një test Kolmogorov-Smirnov me dy bishta. Eksperimenti u përsërit dy herë me rezultate të ngjashme. j Histogramet e frekuencës së orientimit në planin e ndarjes qelizore të IPR rreth P3 (jeshile e lehtë), P4 (jeshile mesatare) dhe P5 (jeshile e errët), përkatësisht. Vlerat P u morën nga një test Kolmogorov-Smirnov me dy bishta. Eksperimenti u përsërit dy herë me rezultate të ngjashme.
Prandaj, më pas hetuam korrelacionin midis sinjalizimit GA dhe aktivitetit të ndarjes së qelizave duke identifikuar muret qelizore të sapoformuara gjatë analizës (Fig. 5e). Kjo qasje na lejoi të matim frekuencën dhe drejtimin e ndarjes së qelizave. Çuditërisht, ne zbuluam se frekuenca e ndarjeve të qelizave në IPR dhe në pjesën tjetër të SAM (jo-IPR, Fig. 5f) ishte e ngjashme, duke treguar se ndryshimet në sinjalizimin GA midis qelizave IPR dhe atyre jo-IPR nuk ndikojnë ndjeshëm në ndarjen e qelizave. Kjo, dhe korrelacioni pozitiv midis sinjalizimit GA dhe anizotropisë së rritjes, na shtynë të shqyrtojmë nëse aktiviteti i sinjalizimit GA mund të ndikojë në orientimin e planit të ndarjes së qelizave. Ne matëm orientimin e murit të ri qelizor si një kënd akut në lidhje me boshtin radial që lidh qendrën e meristemit dhe qendrën e murit të ri qelizor (Fig. 5e-i) dhe vumë re një tendencë të qartë që qelizat të ndahen në kënde afër 90° në raport me boshtin radial, me frekuencat më të larta të vërejtura në 80° (20°) dhe 703-80% (70%). (22.62%) (Fig. 5e,i), që korrespondon me ndarjet qelizore në drejtimin rrethues/tërthor (Fig. 5h). Për të ekzaminuar kontributin e sinjalizimit GA në këtë sjellje të ndarjes së qelizave, ne analizuam veçmas parametrat e ndarjes së qelizave në IPR dhe jo-IPR (Fig. 5i). Ne vumë re se shpërndarja e këndit të ndarjes në qelizat IPR ndryshonte nga ajo në qelizat jo-IPR ose në qelizat në të gjithë SAM, me qelizat IPR që shfaqnin një proporcion më të lartë të ndarjeve të qelizave anësore/rrethore, p.sh., 70-80° dhe 80-90° (33,86% dhe 30,71%, respektivisht, proporcione përkatëse Fig.5). Kështu, vëzhgimet tona zbuluan një lidhje midis sinjalizimit të lartë GA dhe një orientimi të planit të ndarjes qelizore afër drejtimit rrethues, i ngjashëm me korrelacionin midis aktivitetit të sinjalizimit GA dhe anizotropisë së rritjes (Fig. 5c, d). Për të vendosur më tej ruajtjen hapësinore të kësaj shoqërie, ne matëm orientimin e planit të ndarjes në qelizat IPR që rrethojnë primordiumin duke filluar nga P3, pasi aktiviteti më i lartë i sinjalizimit GA u zbulua në këtë rajon duke filluar nga P4 (Fig. 4). Këndet e ndarjes së IPR rreth P3 dhe P4 nuk treguan dallime të rëndësishme statistikisht, megjithëse një frekuencë e rritur e ndarjeve të qelizave anësore u vu re në IPR rreth P4 (Fig. 5j). Megjithatë, në qelizat IPR rreth P5, ndryshimi në orientimin e planit të ndarjes së qelizave u bë statistikisht i rëndësishëm, me një rritje të mprehtë në frekuencën e ndarjeve të qelizave tërthore (Fig. 5j). Së bashku, këto rezultate sugjerojnë se sinjalizimi GA mund të kontrollojë orientimin e ndarjeve qelizore në SAM, gjë që është në përputhje me raportet e mëparshme40,41 se sinjalizimi i lartë GA mund të nxisë orientimin anësor të ndarjeve qelizore në IPR.
Parashikohet që qelizat në IPR nuk do të inkorporohen në primordia, por më tepër në internode2,42,43. Orientimi tërthor i ndarjeve qelizore në IPR mund të rezultojë në organizimin tipik të rreshtave gjatësore paralele të qelizave epidermale në internode. Vëzhgimet tona të përshkruara më sipër sugjerojnë se sinjalizimi GA ka të ngjarë të luajë një rol në këtë proces duke rregulluar drejtimin e ndarjes së qelizave.
Humbja e funksionit të disa gjeneve DELLA rezulton në një përgjigje konstituive GA dhe mutantët della mund të përdoren për të testuar këtë hipotezë44. Ne fillimisht analizuam modelet e shprehjes së pesë gjeneve DELLA në SAM. Shkrirja transkriptuese e linjës GUS45 zbuloi se GAI, RGA, RGL1 dhe RGL2 (në një masë shumë më të vogël) u shprehën në SAM (Figura plotësuese 11a-d). Hibridizimi in situ tregoi më tej se mRNA i GAI grumbullohet në mënyrë specifike në primordia dhe lulet në zhvillim (Figura suplementare 11e). RGL1 dhe RGL3 mRNA u zbuluan në të gjithë mbulesën e SAM dhe në lulet më të vjetra, ndërsa mRNA RGL2 ishte më e bollshme në rajonin kufitar (Figura plotësuese 11f-h). Imazhi konfokal i pRGL3:: RGL3-GFP SAM konfirmoi shprehjen e vëzhguar nga hibridizimi in situ dhe tregoi se proteina RGL3 grumbullohet në pjesën qendrore të SAM (Fig. Suplementare 11i). Duke përdorur linjën pRGA::GFP-RGA, ne zbuluam gjithashtu se proteina RGA grumbullohet në SAM, por bollëku i saj zvogëlohet në kufi duke filluar nga P4 (Fig. Suplementare 11j). Veçanërisht, modelet e shprehjes së RGL3 dhe RGA janë në përputhje me aktivitetin më të lartë të sinjalizimit GA në IPR, siç zbulohet nga qmRGA (Fig. 4). Për më tepër, këto të dhëna tregojnë se të gjitha DELLA-t janë të shprehura në SAM dhe se shprehja e tyre përfshin të gjithë SAM-in.
Më pas analizuam parametrat e ndarjes së qelizave në mutantët e tipit të egër SAM (Ler, kontrolli) dhe gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della pesëfishtë (global) mutantët (Fig. 6a, b). Interesante, ne vëzhguam një ndryshim statistikisht domethënës në shpërndarjen e frekuencave të këndit të ndarjes së qelizave në mutantin global della SAM në krahasim me llojin e egër (Fig. 6c). Ky ndryshim në mutantin della global ishte për shkak të rritjes së frekuencës së këndeve 80-90° (34,71% kundrejt 24,55%) dhe, në një masë më të vogël, këndeve 70-80° (23,78% kundrejt 20,18%), pra, që korrespondon me ndarjet e qelizave tërthore (Fig. Frekuenca e ndarjeve jo tërthor (0-60°) ishte gjithashtu më e ulët në mutantin della global (Fig. 6c). Frekuenca e ndarjeve të qelizave tërthore u rrit ndjeshëm në SAM të mutantit della global (Fig. 6b). Frekuenca e ndarjeve të qelizave tërthore në IPR ishte gjithashtu më e lartë në mutantin della global krahasuar me tipin e egër (Fig. 6d). Jashtë rajonit të IPR, lloji i egër kishte një shpërndarje më uniforme të këndeve të ndarjes së qelizave, ndërsa mutant della global preferonte ndarjet tangjenciale si IPR (Fig. 6e). Ne vlerësuam gjithashtu orientimin e ndarjeve qelizore në SAM të mutantëve pesëfishë të ga2 oksidazës (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 dhe ga2ox6-2), një sfond mutant joaktiv GA në të cilin GA akumulon. Në përputhje me rritjen e niveleve të GA, SAM e tufë lulesh mutant pesëfishtë ga2ox ishte më e madhe se ajo e Col-0 (Fig. Suplementare 12a, b), dhe në krahasim me Col-0, pesëfishi ga2ox SAM tregoi një shpërndarje dukshëm të ndryshme të këndeve të ndarjes qelizore në favor të frekuencës, duke u rritur përsëri nga këndi i frekuencës 50° në 50°. ndarjet (Figura plotësuese 12a–c). Kështu, ne tregojmë se aktivizimi përbërës i sinjalizimit GA dhe akumulimi GA nxisin ndarjet anësore të qelizave në IPR dhe pjesën tjetër të SAM.
a, b Vizualizimi 3D i shtresës L1 të Ler-it të njollosur me PI (a) dhe mutant della global (b) SAM duke përdorur mikroskopin konfokal. Muret e reja qelizore të formuara në SAM (por jo në primordium) gjatë një periudhe 10-orëshe tregohen dhe ngjyrosen sipas vlerave të tyre të këndit. Futja tregon SAM në 0 h. Shiriti i ngjyrave shfaqet në këndin e poshtëm djathtas. Shigjeta në (b) tregon një shembull të skedarëve të rreshtuar të qelizave në mutantin della global. Eksperimenti u përsërit dy herë me rezultate të ngjashme. ce krahasimi i shpërndarjes së frekuencës së orientimeve të planit të ndarjes qelizore në të gjithë SAM (d), IPR (e) dhe jo-IPR (f) midis Ler dhe della globale. Vlerat P u morën duke përdorur një test Kolmogorov-Smirnov me dy bishta. f, g Vizualizimi 3D i imazheve konfokale të bimëve transgjenike të ngjyrosura me PI të Col-0 (i) dhe pCUC2::gai-1-VENUS (j). Panelet (a, b) tregojnë mure të reja qelizore (por jo primordia) të formuara në SAM brenda 10 orëve. Eksperimenti u përsërit dy herë me rezultate të ngjashme. h–j Krahasimi i shpërndarjes së frekuencës së orientimeve të planit të ndarjes qelizore të vendosura në të gjithë SAM (h), IPR (i) dhe jo-IPR (j) midis bimëve Col-0 dhe pCUC2::gai-1-VENUS. Vlerat P u morën duke përdorur një test Kolmogorov-Smirnov me dy bishta.
Më pas testuam efektin e frenimit të sinjalizimit GA në mënyrë specifike në IPR. Për këtë qëllim, ne përdorëm promotorin e kupës cotyledon 2 (CUC2) për të nxitur shprehjen e një proteine dominuese negative gai-1 të shkrirë me VENUS (në linjën pCUC2::gai-1-VENUS). Në SAM-in e tipit të egër, promotori CUC2 nxit shprehjen e shumicës së IPR-ve në SAM, duke përfshirë qelizat kufitare, nga P4 e tutje, dhe shprehje specifike e ngjashme u vu re në bimët pCUC2::gai-1-VENUS (shih më poshtë). Shpërndarja e këndeve të ndarjes së qelizave nëpër SAM ose IPR të bimëve pCUC2::gai-1-VENUS nuk ishte dukshëm e ndryshme nga ajo e tipit të egër, megjithëse papritur zbuluam se qelizat pa një IPR në këto bimë ndaheshin në një frekuencë më të lartë prej 80-90° (Fig. 6f-j).
Është sugjeruar që drejtimi i ndarjes së qelizave varet nga gjeometria e SAM-it, në veçanti nga sforcimi në tërheqje i krijuar nga lakimi i indeve46. Prandaj ne pyetëm nëse forma e SAM ishte ndryshuar në mutantin della global dhe bimët pCUC2::gai-1-VENUS. Siç u raportua më parë12, madhësia e mutantit della global SAM ishte më e madhe se ajo e tipit të egër (Figura plotësuese 13a, b, d). Hibridizimi in situ i CLV3 dhe STM ARN konfirmoi zgjerimin e meristemit në mutantët della dhe më tej tregoi zgjerimin anësor të kamares së qelizave burimore (Fig. suplementare 13e, f, h, i). Megjithatë, lakimi SAM ishte i ngjashëm në të dy gjenotipet (Figura plotësuese 13k, m, n, p). Ne vumë re një rritje të ngjashme në madhësi në mutantin e katërfishtë gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della pa një ndryshim në lakim në krahasim me llojin e egër (Figura plotësuese 13c, d, g, j, l, o, p). Frekuenca e orientimit të ndarjes qelizore u ndikua gjithashtu në mutantin e katërfishtë della, por në një masë më të vogël se në mutantin monolit della (Figura plotësuese 12d-f). Ky efekt dozimi, së bashku me mungesën e një efekti në lakimin, sugjeron që aktiviteti i mbetur i RGL3 në mutantin e katërfishtë Della kufizon ndryshimet në orientimin e ndarjes qelizore të shkaktuara nga humbja e aktivitetit të DELLA dhe se ndryshimet në ndarjet anësore të qelizave ndodhin si përgjigje ndaj ndryshimeve në aktivitetin e sinjalizimit GA dhe jo ndryshimeve në gjeometrinë SAM. Siç përshkruhet më sipër, promotori CUC2 drejton shprehjen e IPR në SAM duke filluar nga P4 (Fig. Suplementare 14a, b), dhe në të kundërt, pCUC2::gai-1-VENUS SAM kishte një madhësi të reduktuar, por lakim më të lartë (Figura plotësuese 14c–h). Ky ndryshim në morfologjinë pCUC2::gai-1-VENUS SAM mund të rezultojë në një shpërndarje të ndryshme të sforcimeve mekanike në krahasim me llojin e egër, në të cilin sforcimet e larta rrethore fillojnë në një distancë më të shkurtër nga qendra SAM47. Përndryshe, ndryshimet në morfologjinë pCUC2::gai-1-VENUS SAM mund të rezultojnë nga ndryshimet në vetitë mekanike rajonale të shkaktuara nga shprehja transgjenike48. Në të dyja rastet, kjo mund të kompensojë pjesërisht efektet e ndryshimeve në sinjalizimin GA duke rritur gjasat që qelizat të ndahen në orientimin rrethues/tërthor, duke shpjeguar vëzhgimet tona.
Të marra së bashku, të dhënat tona konfirmojnë se sinjalizimi më i lartë GA luan një rol aktiv në orientimin anësor të planit të ndarjes së qelizave në IPR. Ato tregojnë gjithashtu se lakimi i meristemit ndikon gjithashtu në orientimin e planit të ndarjes së qelizave në IPR.
Orientimi tërthor i rrafshit të ndarjes në IPR, për shkak të aktivitetit të lartë të sinjalizimit GA, sugjeron që GA para-organizon një skedar qelizor radial në epidermë brenda SAM për të përcaktuar organizimin qelizor që do të gjendet më vonë në ndërnyjën epidermale. Në të vërtetë, skedarë të tillë qelizash ishin shpesh të dukshme në imazhet SAM të mutantëve della global (Fig. 6b). Kështu, për të eksploruar më tej funksionin zhvillimor të modelit hapësinor të sinjalizimit GA në SAM, ne përdorëm imazhe me kalim kohe për të analizuar organizimin hapësinor të qelizave në IPR në bimët transgjenike të tipit të egër (Ler dhe Col-0), mutantët della global dhe pCUC2::gai-1-VENUS.
Ne zbuluam se qmRGA tregoi se aktiviteti i sinjalizimit GA në IPR u rrit nga P1/P2 dhe arriti kulmin në P4, dhe ky model mbeti konstant me kalimin e kohës (Fig. 4a-f dhe Figura plotësuese 8c-f, k). Për të analizuar organizimin hapësinor të qelizave në IPR me rritjen e sinjalit GA, ne etiketuam qelizat Ler IPR sipër dhe në anët e P4 sipas fatit të tyre të zhvillimit të analizuar 34 orë pas vëzhgimit të parë, pra më shumë se dy herë plastide, duke na lejuar të ndjekim qelizat IPR gjatë zhvillimit të primordiumit nga P1/P2 në P4. Ne përdorëm tre ngjyra të ndryshme: të verdhë për ato qeliza që ishin integruar në primordium pranë P4, jeshile për ato që ishin në IPR dhe vjollcë për ato që morën pjesë në të dy proceset (Fig. 7a-c). Në t0 (0 orë), 1-2 shtresa të qelizave IPR ishin të dukshme përpara P4 (Fig. 7a). Siç pritej, kur këto qeliza u ndanë, ato e bënë këtë kryesisht nëpërmjet rrafshit të ndarjes tërthore (Fig. 7a-c). Rezultate të ngjashme u morën duke përdorur Col-0 SAM (duke u fokusuar në P3, kufiri i të cilit paloset në mënyrë të ngjashme me P4 në Ler), megjithëse në këtë gjenotip palosja e formuar në kufirin e lules fshehu qelizat IPR më shpejt (Fig. 7g-i). Kështu, modeli i ndarjes së qelizave IPR para-organizon qelizat në rreshta radiale, si në internode. Organizimi i rreshtave radiale dhe lokalizimi i qelizave IPR midis organeve të njëpasnjëshme sugjeron që këto qeliza janë paraardhëse ndërnyjore.
Këtu, ne zhvilluam një biosensor sinjalizues ratiometrik GA, qmRGA, që lejon hartëzimin sasior të aktivitetit të sinjalizimit GA që rezulton nga përqendrimet e kombinuara të receptorëve GA dhe GA duke minimizuar ndërhyrjen në rrugët endogjene të sinjalizimit, duke siguruar kështu informacion mbi funksionin GA në nivel qelizor. Për këtë qëllim, ne ndërtuam një proteinë DELLA të modifikuar, mRGA, që ka humbur aftësinë për të lidhur partnerët e ndërveprimit DELLA, por mbetet e ndjeshme ndaj proteolizës së induktuar nga GA. qmRGA i përgjigjet ndryshimeve ekzogjene dhe endogjene në nivelet e GA, dhe vetitë e tij dinamike të ndjeshmërisë mundësojnë vlerësimin e ndryshimeve hapësinore në aktivitetin e sinjalizimit GA gjatë zhvillimit. qmRGA është gjithashtu një mjet shumë fleksibël pasi mund të përshtatet në inde të ndryshme duke ndryshuar promotorin e përdorur për shprehjen e tij (nëse është e nevojshme), dhe duke pasur parasysh natyrën e konservuar të rrugës së sinjalizimit GA dhe motivin PFYRE nëpër angiosperma, ka të ngjarë të jetë i transferueshëm në specie të tjera22. Në përputhje me këtë, një mutacion ekuivalent në proteinën SLR1 DELLA të orizit (HYY497AAA) u tregua gjithashtu se shtyp aktivitetin e represorit të rritjes së SLR1, ndërsa vetëm pak ul degradimin e tij të ndërmjetësuar nga GA, i ngjashëm me mRGA23. Veçanërisht, studimet e fundit në Arabidopsis treguan se një mutacion i vetëm i aminoacideve në domenin PFYRE (S474L) ndryshoi aktivitetin transkriptues të RGA pa ndikuar në aftësinë e tij për të ndërvepruar me partnerët e faktorit të transkriptimit50. Megjithëse ky mutacion është shumë afër 3 zëvendësimeve të aminoacideve të pranishme në mRGA, studimet tona tregojnë se këto dy mutacione ndryshojnë karakteristikat e dallueshme të DELLA. Megjithëse shumica e partnerëve të faktorit të transkriptimit lidhen me domenet LHR1 dhe SAW të DELLA26,51, disa aminoacide të konservuara në domenin PFYRE mund të ndihmojnë në stabilizimin e këtyre ndërveprimeve.
Zhvillimi i ndërnyjeve është një tipar kyç në arkitekturën e bimëve dhe përmirësimin e rendimentit. qmRGA zbuloi aktivitet më të lartë sinjalizues GA në qelizat paraardhëse të ndërnyjeve IPR. Duke kombinuar imazhet sasiore dhe gjenetikën, ne treguam se modelet e sinjalizimit GA mbivendosen plane të ndarjes qelizore rrethore/tërthore në epidermën SAM, duke formuar organizimin e ndarjes qelizore të kërkuar për zhvillimin e ndërnyjeve. Gjatë zhvillimit janë identifikuar disa rregullatorë të orientimit në planin e ndarjes qelizore52,53. Puna jonë ofron një shembull të qartë se si aktiviteti i sinjalizimit GA rregullon këtë parametër celular. DELLA mund të ndërveprojë me komplekset e proteinave të parapalosura41, kështu që sinjalizimi GA mund të rregullojë orientimin në planin e ndarjes qelizore duke ndikuar drejtpërdrejt në orientimin e mikrotubulave kortikale40,41,54,55. Ne treguam papritur se në SAM, korrelacioni i aktivitetit më të lartë të sinjalizimit GA nuk ishte zgjatja ose ndarja e qelizave, por vetëm anizotropia e rritjes, e cila është në përputhje me një efekt të drejtpërdrejtë të GA në drejtimin e ndarjes së qelizave në IPR. Megjithatë, nuk mund të përjashtojmë që ky efekt mund të jetë gjithashtu indirekt, për shembull i ndërmjetësuar nga zbutja e murit qelizor të shkaktuar nga GA56. Ndryshimet në vetitë e murit qelizor nxisin stresin mekanik57,58, i cili gjithashtu mund të ndikojë në orientimin e planit të ndarjes qelizore duke ndikuar në orientimin e mikrotubulave kortikale39,46,59. Efektet e kombinuara të stresit mekanik të shkaktuar nga GA dhe rregullimi i drejtpërdrejtë i orientimit të mikrotubulave nga GA mund të përfshihen në gjenerimin e një modeli specifik të orientimit të ndarjes qelizore në IPR për të përcaktuar ndërnyjet dhe nevojiten studime të mëtejshme për të testuar këtë ide. Në mënyrë të ngjashme, studimet e mëparshme kanë theksuar rëndësinë e proteinave TCP14 dhe 15 që ndërveprojnë me DELLA në kontrollin e formimit të ndërnyjeve60,61 dhe këta faktorë mund të ndërmjetësojnë veprimin e GA së bashku me BREVIPEDICELLUS (BP) dhe PENNYWISE (PNY), të cilat rregullojnë zhvillimin e ndërnyjeve dhe kanë treguar se ndikojnë26. Duke pasur parasysh se DELLA-t ndërveprojnë me rrugët sinjalizuese brassinosteroid, etilen, acid jasmonik dhe acid abscisik (ABA)63,64 dhe se këto hormone mund të ndikojnë në orientimin e mikrotubulave65, efektet e GA në orientimin e ndarjes qelizore mund të ndërmjetësohen edhe nga hormone të tjera.
Studimet e hershme citologjike treguan se si rajonet e brendshme ashtu edhe ato të jashtme të Arabidopsis SAM janë të nevojshme për zhvillimin e ndërnyjeve2,42. Fakti që GA rregullon në mënyrë aktive ndarjen qelizore në indet e brendshme12 mbështet një funksion të dyfishtë të GA në rregullimin e madhësisë së meristemit dhe internodit në SAM. Modeli i ndarjes së qelizave të drejtimit është gjithashtu i rregulluar fort në indin e brendshëm të SAM, dhe ky rregullim është thelbësor për rritjen e rrjedhjes52. Do të jetë interesante të shqyrtohet nëse GA gjithashtu luan një rol në orientimin e planit të ndarjes qelizore në organizimin e brendshëm të SAM, duke sinkronizuar kështu specifikimin dhe zhvillimin e ndërnyjeve brenda SAM.
Bimët u rritën in vitro në tokë ose 1x mjedis Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) i plotësuar me 1% saharozë dhe 1% agar (Sigma) në kushte standarde (dritë 16 orë, 22 °C), me përjashtim të eksperimenteve të hipokotilit dhe rritjes së rrënjëve në të cilat fidanët u rritën në pllaka vertikale 22 °C nën dritë konstante. Për eksperimentet e nitrateve, bimët u rritën në mjedis të modifikuar MS (medium bimor bioWORLD) i plotësuar me nitrat adekuat (0 ose 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-sukcinat, 1% saharozë dhe 1% A-agar (Sigma) në kushte të gjata ditore.
GID1a cDNA e futur në pDONR221 u rikombinua me pDONR P4-P1R-pUBQ10 dhe pDONR P2R-P3-mCherry në pB7m34GW për të gjeneruar pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2 ADN-ja e futur në pDONR221 u rikombinua në pB7RWG266 për të gjeneruar p35S:IDD2-RFP. Për të gjeneruar pGID1b:: 2xmTQ2-GID1b, një fragment 3.9 kb në rrjedhën e sipërme të rajonit kodues GID1b dhe një fragment 4.7 kb që përmban cDNA-në GID1b (1.3 kb) dhe terminatorin (3.4 kb) fillimisht u përforcuan duke përdorur abetaret në Tabelën Suplementare PRmoR4 dhe më pas. Fisher Scientific) dhe pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), përkatësisht, dhe më në fund u rikombinuar me pDONR221 2xmTQ268 në vektorin e synuar pGreen 012567 duke përdorur klonimin Gateway. Për të gjeneruar pCUC2:: LSSmOrange, sekuenca e promotorit CUC2 (3229 bp në rrjedhën e sipërme të ATG) e ndjekur nga sekuenca koduese e mOrange-it të madh të zhvendosur nga Stokes (LSSmOrange)69 me sinjalin e lokalizimit bërthamor N7 dhe terminatorin transkriptues NOS u mblodhën duke përdorur vecinën e synuar G. Sistemi i rikombinimit me 3 fragmente (Invitrogen). Vektori binar binar u fut në shtamin Agrobacterium tumefaciens GV3101 dhe u fut në gjethet Nicotiana benthamiana me metodën e infiltrimit Agrobacterium dhe në Arabidopsis thaliana Col-0 me metodën e zhytjes me lule, përkatësisht. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry dhe pCLV3::mCherry-NLS qmRGA u izoluan nga pasardhësit F3 dhe F1 të kryqëzimeve përkatëse, përkatësisht.
Hibridizimi in situ i ARN-së u krye në majat e lastarëve me gjatësi afërsisht 1 cm72, të cilat u mblodhën dhe u fiksuan menjëherë në tretësirën FAA (3,7% formaldehid, 5% acid acetik, 50% etanol) të ftohur paraprakisht në 4 °C. Pas trajtimeve me vakum 2 × 15 min, fiksuesi u ndryshua dhe mostrat u inkubuan gjatë natës. cDNA-të GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 dhe RGL3 dhe sondat antisense ndaj 3'-UTR-ve të tyre u sintetizuan duke përdorur primerët e treguar në Tabelën Suplementare 3 siç përshkruhet nga Rosier et al.73. Sondat e etiketuara me digoksigjeninë u imunodetektuan duke përdorur antitrupa të digoksigjeninës (hollimi 3000 herë; Roche, numri i katalogut: 11 093 274 910), dhe seksionet u ngjyrosën me 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat (BCIP-indolil-fosfat/0-indolil, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 1, 2, 4, 5, 6, 6, 6, 6, 6, 6, 6, 6, 6, 6, 6, 6) (NBT, hollim 200-fish) tretësirë.
Koha e postimit: Shkurt-10-2025