Në këtë studim, efektet stimuluese të trajtimit të kombinuar tërregullatorët e rritjes së bimëve(2,4-D dhe kinetinë) dhe nanopjesëzat e oksidit të hekurit (Fe₃O₄-NPs) në morfogjenezën in vitro dhe prodhimin e metabolitëve sekondarë në *Hypericum perforatum* L. u studiuan. Trajtimi i optimizuar [2,4-D (0.5 mg/L) + kinetinë (2 mg/L) + Fe₃O₄-NPs (4 mg/L)] përmirësoi ndjeshëm parametrat e rritjes së bimëve: lartësia e bimës u rrit me 59.6%, gjatësia e rrënjës me 114.0%, numri i sythave me 180.0% dhe pesha e freskët e kallusit me 198.3% krahasuar me grupin e kontrollit. Ky trajtim i kombinuar gjithashtu rriti efikasitetin e rigjenerimit (50.85%) dhe rriti përmbajtjen e hipericinës me 66.6%. Analiza GC-MS zbuloi përmbajtje të larta të hiperosidit, β-patolenit dhe alkoolit cetil, që përbëjnë 93.36% të sipërfaqes totale të pikut, ndërsa përmbajtja e fenolikëve dhe flavonoideve totale u rrit deri në 80.1%. Këto rezultate tregojnë se rregullatorët e rritjes së bimëve (PGR) dhe nanopjesëzat Fe₃O₄ (Fe₃O₄-NPs) ushtrojnë një efekt sinergjik duke stimuluar organogjenezën dhe akumulimin e komponimeve bioaktive, gjë që përfaqëson një strategji premtuese për përmirësimin bioteknologjik të bimëve medicinale.
Luleshtrydhe (Hypericum perforatum L.), e njohur edhe si luleshtrydhe, është një bimë barishtore shumëvjeçare e familjes Hypericaceae që ka vlerë ekonomike.[1] Komponentët e saj të mundshëm bioaktivë përfshijnë taninet natyrale, ksantone, floroglucinol, naftalendiantron (hiperinë dhe pseudohiperinë), flavonoide, acide fenolike dhe vajra esencialë.[2,3,4] Luleshtrydhe mund të përhapet me metoda tradicionale; megjithatë, sezonaliteti i metodave tradicionale, mbirja e ulët e farave dhe ndjeshmëria ndaj sëmundjeve kufizojnë potencialin e tij për kultivim në shkallë të gjerë dhe formimin e vazhdueshëm të metabolitëve sekondarë.[1,5,6]
Kështu, kultura e indeve in vitro konsiderohet një metodë efektive për përhapjen e shpejtë të bimëve, ruajtjen e burimeve të germoplazmës dhe rritjen e rendimentit të përbërjeve medicinale [7, 8]. Rregullatorët e rritjes së bimëve (PGR) luajnë një rol vendimtar në rregullimin e morfogjenezës dhe janë të nevojshëm për kultivimin in vitro të kallusit dhe të organizmave të tërë. Optimizimi i përqendrimeve dhe kombinimeve të tyre është thelbësor për përfundimin me sukses të këtyre proceseve zhvillimore [9]. Prandaj, të kuptuarit e përbërjes dhe përqendrimit të duhur të rregullatorëve është i rëndësishëm për përmirësimin e kapacitetit të rritjes dhe rigjenerimit të barit të Shën Gjonit (H. perforatum) [10].
Nanopjesëzat e oksidit të hekurit (Fe₃O₄) janë një klasë nanopjesëzash që janë zhvilluar ose po zhvillohen për kulturën e indeve. Fe₃O₄ ka veti të rëndësishme magnetike, biokompatibilitet të mirë dhe aftësinë për të nxitur rritjen e bimëve dhe për të zvogëluar stresin mjedisor, kështu që ka tërhequr vëmendje të konsiderueshme në dizajnet e kulturës së indeve. Zbatimet e mundshme të këtyre nanopjesëzave mund të përfshijnë optimizimin e kulturës in vitro për të nxitur ndarjen qelizore, për të përmirësuar thithjen e lëndëve ushqyese dhe për të aktivizuar enzimat antioksiduese [11].
Edhe pse nanopjesëzat kanë treguar efekte të mira nxitëse në rritjen e bimëve, studimet mbi aplikimin e kombinuar të nanopjesëzave Fe₃O₄ dhe rregullatorëve të optimizuar të rritjes së bimëve në *H. perforatum* mbeten të pakta. Për të mbushur këtë boshllëk njohurish, ky studim vlerësoi efektet e efekteve të tyre të kombinuara në morfogjenezën in vitro dhe prodhimin e metabolitëve sekondarë për të ofruar njohuri të reja për përmirësimin e karakteristikave të bimëve medicinale. Prandaj, ky studim ka dy objektiva: (1) optimizimin e përqendrimit të rregullatorëve të rritjes së bimëve për të nxitur në mënyrë efektive formimin e kallusit, rigjenerimin e lastarëve dhe rrënjosjen in vitro; dhe (2) vlerësimin e efekteve të nanopjesëzave Fe₃O₄ në parametrat e rritjes in vitro. Planet e ardhshme përfshijnë vlerësimin e shkallës së mbijetesës së bimëve të rigjeneruara gjatë aklimatizimit (in vitro). Pritet që rezultatet e këtij studimi të përmirësojnë ndjeshëm efikasitetin e mikropërhapjes së *H. perforatum*, duke kontribuar kështu në përdorimin e qëndrueshëm dhe aplikimet bioteknologjike të kësaj bime të rëndësishme medicinale.
Në këtë studim, ne morëm eksplante gjethesh nga bimët vjetore të barit të Shën Gjonit (bimë mëmë) të rritura në fushë. Këto eksplante u përdorën për të optimizuar kushtet e kulturës in vitro. Para kultivimit, gjethet u shpëlanë plotësisht nën ujë të rrjedhshëm të distiluar për disa minuta. Sipërfaqet e eksplanteve u dezinfektuan më pas duke u zhytur në 70% etanol për 30 sekonda, e më pas duke u zhytur në një tretësirë 1.5% hipoklorit natriumi (NaOCl) që përmbante disa pika Tween 20 për 10 minuta. Së fundmi, eksplantet u shpëlanë tri herë me ujë të distiluar steril para se të transferoheshin në mjedisin tjetër të kulturës.
Gjatë katër javëve të ardhshme, u matën parametrat e rigjenerimit të lastarëve, duke përfshirë shkallën e rigjenerimit, numrin e lastarëve për çdo eksplant dhe gjatësinë e lastarëve. Kur lastarët e rigjeneruar arritën një gjatësi prej të paktën 2 cm, ato u transferuan në një mjedis rrënjosjeje të përbërë nga mjedis MS me gjysmë përqendrimi, acid indolebutirik (IBA) 0.5 mg/L dhe 0.3% gomë guar. Kultura e rrënjosjes vazhdoi për tre javë, gjatë së cilës kohë u matën shkalla e rrënjosjes, numri i rrënjëve dhe gjatësia e rrënjëve. Çdo trajtim u përsërit tre herë, me 10 eksplante të kultivuara për çdo përsëritje, duke dhënë afërsisht 30 eksplante për trajtim.
Lartësia e bimës u mat në centimetra (cm) duke përdorur një vizore, nga baza e bimës deri në majën e gjethes më të lartë. Gjatësia e rrënjës u mat në milimetra (mm) menjëherë pas heqjes me kujdes të fidanëve dhe heqjes së mjedisit të rritjes. Numri i sythave për eksplant u numërua direkt në secilën bimë. Numri i njollave të zeza në gjethe, të njohura si nyje, u mat vizualisht. Këto nyje të zeza besohet të jenë gjëndra që përmbajnë hipericinë, ose njolla oksiduese, dhe përdoren si një tregues fiziologjik i përgjigjes së bimës ndaj trajtimit. Pas heqjes së të gjithë mjedisit të rritjes, pesha e freskët e fidanëve u mat duke përdorur një peshore elektronike me një saktësi prej miligramësh (mg).
Metoda për llogaritjen e shkallës së formimit të kallusit është si më poshtë: pas kultivimit të eksplanteve në një mjedis që përmban rregullatorë të ndryshëm të rritjes (kinaza, 2,4-D dhe Fe3O4) për katër javë, numërohet numri i eksplanteve të afta për të formuar kallus. Formula për llogaritjen e shkallës së formimit të kallusit është si më poshtë:
Çdo trajtim u përsërit tri herë, me të paktën 10 eksplante të ekzaminuara në secilën përsëritje.
Shkalla e rigjenerimit pasqyron përqindjen e indit të kallusit që përfundon me sukses procesin e diferencimit të sythave pas fazës së formimit të kallusit. Ky tregues tregon aftësinë e indit të kallusit për t'u transformuar në ind të diferencuar dhe për t'u rritur në organe të reja të bimës.
Koeficienti i rrënjosjes është raporti i numrit të degëve të afta për të rrënjosur me numrin total të degëve. Ky tregues pasqyron suksesin e fazës së rrënjosjes, e cila është thelbësore në mikroshumimin dhe përhapjen e bimëve, pasi rrënjosja e mirë i ndihmon fidanët të mbijetojnë më mirë në kushtet e rritjes.
Komponimet e hipericinës u nxorën me 90% metanol. Pesëdhjetë mg material bimor i tharë u shtuan në 1 ml metanol dhe u nënshtruan ultratingujve për 20 minuta në 30 kHz në një pastrues tejzanor (modeli A5120-3YJ) në temperaturë ambienti në errësirë. Pas ultratingujve, mostra u centrifugua në 6000 rpm për 15 minuta. Supernatanti u mblodh dhe thithja e hipericinës u mat në 592 nm duke përdorur një spektrofotometër Plus-3000 S sipas metodës së përshkruar nga Conceiçao et al. [14].
Shumica e trajtimeve me rregullatorë të rritjes së bimëve (PGR) dhe nanopjesëza të oksidit të hekurit (Fe₃O₄-NP) nuk shkaktuan formimin e nyjeve të zeza në gjethet e rigjeneruara të lastarëve. Nuk u vunë re nyje në asnjë nga trajtimet me 0.5 ose 1 mg/L 2,4-D, 0.5 ose 1 mg/L kinetinë, ose 1, 2 ose 4 mg/L nanopjesëza të oksidit të hekurit. Disa kombinime treguan një rritje të lehtë në zhvillimin e nyjeve (por jo statistikisht të rëndësishme) në përqendrime më të larta të kinetinës dhe/ose nanopjesëzave të oksidit të hekurit, siç është kombinimi i 2,4-D (0.5–2 mg/L) me kinetinë (1–1.5 mg/L) dhe nanopjesëza të oksidit të hekurit (2–4 mg/L). Këto rezultate tregohen në Figurën 2. Nodulet e zeza përfaqësojnë gjëndra të pasura me hipericinë, të dyja natyrale dhe të dobishme. Në këtë studim, nyjet e zeza u shoqëruan kryesisht me nxirjen në kafe të indeve, duke treguar një mjedis të favorshëm për akumulimin e hipericinës. Trajtimi me nanopjesëza 2,4-D, kinetin dhe Fe₃O₄ nxiti rritjen e kallusit, uli ngjyrën e kafesë dhe rriti përmbajtjen e klorofilit, duke sugjeruar funksion të përmirësuar metabolik dhe ulje të mundshme të dëmtimit oksidativ [37]. Ky studim vlerësoi efektet e kinetinës në kombinim me nanopjesëzat 2,4-D dhe Fe₃O₄ në rritjen dhe zhvillimin e kallusit të barit të Shën Gjonit (Fig. 3a–g). Studimet e mëparshme kanë treguar se nanopjesëzat Fe₃O₄ kanë aktivitete antifungale dhe antimikrobike [38, 39] dhe, kur përdoren në kombinim me rregullatorët e rritjes së bimëve, mund të stimulojnë mekanizmat mbrojtës të bimëve dhe të zvogëlojnë indekset e stresit qelizor [18]. Megjithëse biosinteza e metabolitëve sekondarë është e rregulluar gjenetikisht, rendimenti i tyre aktual varet shumë nga kushtet mjedisore. Ndryshimet metabolike dhe morfologjike mund të ndikojnë në nivelet e metabolitëve sekondarë duke rregulluar shprehjen e gjeneve specifike të bimëve dhe duke iu përgjigjur faktorëve mjedisorë. Për më tepër, induktorët mund të shkaktojnë aktivizimin e gjeneve të reja, të cilat nga ana tjetër stimulojnë aktivitetin enzimatik, duke aktivizuar në fund të fundit rrugë të shumta biosintetike dhe duke çuar në formimin e metabolitëve sekondarë. Për më tepër, një studim tjetër tregoi se zvogëlimi i hijes rrit ekspozimin ndaj rrezeve të diellit, duke rritur kështu temperaturat e ditës në habitatin natyror të *Hypericum perforatum*, gjë që gjithashtu kontribuon në rritjen e prodhimit të hipericinës. Bazuar në këto të dhëna, ky studim hetoi rolin e nanopjesëzave të hekurit si induktorë të mundshëm në kulturën e indeve. Rezultatet treguan se këto nanopjesëza mund të aktivizojnë gjenet e përfshira në biosintezën e hesperidinës përmes stimulimit enzimatik, duke çuar në rritjen e akumulimit të këtij përbërësi (Fig. 2). Prandaj, krahasuar me bimët që rriten në kushte natyrore, mund të argumentohet se prodhimi i përbërësve të tillë in vivo mund të rritet edhe kur stresi i moderuar kombinohet me aktivizimin e gjeneve të përfshira në biosintezën e metabolitëve sekondarë. Trajtimet e kombinuara në përgjithësi kanë një efekt pozitiv në shkallën e rigjenerimit, por në disa raste, ky efekt dobësohet. Veçanërisht, trajtimi me 1 mg/L 2,4-D, 1.5 mg/L kinazë dhe përqendrime të ndryshme mund të rrisë në mënyrë të pavarur dhe të konsiderueshme shkallën e rigjenerimit me 50.85% krahasuar me grupin e kontrollit (Fig. 4c). Këto rezultate sugjerojnë që kombinime specifike të nanohormoneve mund të veprojnë në mënyrë sinergjike për të nxitur rritjen e bimëve dhe prodhimin e metabolitëve, gjë që ka një rëndësi të madhe për kulturën e indeve të bimëve medicinale. Palmer dhe Keller [50] treguan se trajtimi 2,4-D mund të nxisë në mënyrë të pavarur formimin e kallusit në St. perforatum, ndërsa shtimi i kinazës rriti ndjeshëm formimin dhe rigjenerimin e kallusit. Ky efekt ishte për shkak të përmirësimit të ekuilibrit hormonal dhe stimulimit të ndarjes qelizore. Bal et al. [51] zbuluan se trajtimi me Fe₃O₄-NP mund të përmirësonte në mënyrë të pavarur funksionin e enzimave antioksiduese, duke nxitur kështu rritjen e rrënjëve në St. perforatum. Mediat e kulturës që përmbajnë nanopjesëza Fe₃O₄ në përqendrime prej 0.5 mg/L, 1 mg/L dhe 1.5 mg/L përmirësuan shkallën e rigjenerimit të bimëve të lirit [52]. Përdorimi i kinetinës, 2,4-diklorobenzotiazolinonës dhe nanopjesëzave Fe₃O₄ përmirësoi ndjeshëm shkallën e formimit të kallusit dhe rrënjës, megjithatë, duhet të merren në konsideratë efektet anësore të mundshme të përdorimit të këtyre hormoneve për rigjenerimin in vitro. Për shembull, përdorimi afatgjatë ose me përqendrim të lartë i 2,4-diklorobenzotiazolinonës ose kinetinës mund të rezultojë në variacion klonal somatik, stres oksidativ, morfologji jonormale të kallusit ose vitrifikim. Prandaj, një shkallë e lartë rigjenerimi nuk parashikon domosdoshmërisht stabilitetin gjenetik. Të gjitha bimët e rigjeneruara duhet të vlerësohen duke përdorur shënjues molekularë (p.sh. RAPD, ISSR, AFLP) ose analiza citogjenetike për të përcaktuar homogjenitetin dhe ngjashmërinë e tyre me bimët in vivo [53,54,55].
Ky studim demonstroi për herë të parë se përdorimi i kombinuar i rregullatorëve të rritjes së bimëve (2,4-D dhe kinetinë) me nanopjesëzat Fe₃O₄ mund të përmirësojë morfogjenezën dhe akumulimin e metabolitëve kryesorë bioaktivë (duke përfshirë hipericinën dhe hiperozidin) në *Hypericum perforatum*. Regjimi i optimizuar i trajtimit (1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L kinetinë + 4 mg/L Fe₃O₄-NPs) jo vetëm që maksimizoi formimin e kallusit, organogjenezën dhe rendimentin e metabolitëve sekondarë, por gjithashtu demonstroi një efekt të lehtë nxitës, duke përmirësuar potencialisht tolerancën ndaj stresit dhe vlerën medicinale të bimës. Kombinimi i nanoteknologjisë dhe kulturës së indeve bimore ofron një platformë të qëndrueshme dhe efikase për prodhimin in vitro në shkallë të gjerë të përbërjeve medicinale. Këto rezultate hapin rrugën për aplikime industriale dhe kërkime të ardhshme mbi mekanizmat molekularë, optimizimin e dozimit dhe saktësinë gjenetike, duke lidhur kështu kërkimin themelor mbi bimët medicinale me bioteknologjinë praktike.
Koha e postimit: 12 dhjetor 2025