Ilaçi antihelmintik N,N-dietil-m-toluamide (DEET) është raportuar se frenon AChE (acetilkolinesterazën) dhe ka veti të mundshme kancerogjene për shkak të vaskularizimit të tepruar. Në këtë punim, ne tregojmë se DEET stimulon në mënyrë specifike qelizat endoteliale që nxisin angiogjenezën, duke rritur kështu rritjen e tumorit. DEET aktivizon proceset qelizore që çojnë në angiogjenezë, duke përfshirë përhapjen, migrimin dhe ngjitjen. Kjo shoqërohet me rritjen e prodhimit të NO dhe shprehjes së VEGF në qelizat endoteliale. Heshtja e M3 ose përdorimi i frenuesve farmakologjikë M3 i hoqi të gjitha këto efekte, duke sugjeruar se angiogjeneza e induktuar nga DEET është e ndjeshme ndaj M3. Eksperimentet që përfshijnë sinjalizimin e kalciumit në qelizat endoteliale dhe HEK që mbishprehin receptorët M3, si dhe studimet e lidhjes dhe lidhjes, tregojnë se DEET vepron si një modulator alosterik i receptorëve M3. Për më tepër, DEET frenon AChE, duke rritur kështu disponueshmërinë biologjike të acetilkolinës dhe lidhjen e saj me receptorët M3, dhe duke rritur efektet proangiogjenike përmes rregullimit alosterik.
EC-të primare u izoluan nga aorta e minjve zviceranë. Metoda e nxjerrjes është përshtatur nga protokolli Kobayashi 26 . EC-et e murit u kultivuan në mjedis EBM-2 të plotësuar me 5% FBS të inaktivizuar nga nxehtësia deri në kalimin e katërt.
Efekti i dy përqendrimeve të DEET në përhapjen e HUVEC, U87MG, ose BF16F10 u analizua duke përdorur kompletin e analizës së përhapjes së qelizave CyQUANT (Sonda molekulare, C7026). Shkurtimisht, 5.103 qeliza për pus u mbollën në një pjatë 96 pusesh, u lanë të ngjiteshin gjatë natës dhe më pas u trajtuan me DEET për 24 orë. Pas heqjes së mjedisit të rritjes, shtoni tretësirë lidhëse ngjyruese në çdo pus të mikropllakës dhe inkuboni qelizat në 37 °C për 30 minuta. Nivelet e fluoreshencës u përcaktuan duke përdorur një lexues mikropllakash multimodale Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Gjermani) i pajisur me filtra ngacmimi 485 nm dhe filtra emetimi 530 nm.
HUVEC u mbollën në pllaka 96 pusesh me një densitet prej 104 qelizash për pus. Qelizat u trajtuan me DEET për 24 orë. Qëndrueshmëria e qelizave u vlerësua duke përdorur një analizë kolorimetrike MTT (Sigma-Aldrich, M5655). Vlerat e densitetit optik u morën në një lexues multimodësh të mikropllakës (Mithras LB940) në një gjatësi vale prej 570 nm.
Efektet e DEET u studiuan duke përdorur analizat e angiogjenezës in vitro. Trajtimi me 10-8 M ose 10-5 M DEET rriti formimin e gjatësisë së kapilarëve në HUVEC (Fig. 1a, b, shirita të bardhë). Krahasuar me grupin e kontrollit, trajtimi me përqendrime DEET që varionin nga 10-14 në 10-5 M tregoi se gjatësia e kapilarëve arriti një pllajë në 10-8 M DEET (Figura Suplementare S2). Nuk u gjet asnjë ndryshim domethënës në efektin proangiogjen in vitro të HUVEC-ve të trajtuara me DEET në intervalin e përqendrimit 10-8 M dhe 10-5 M.
Për të përcaktuar efektin e DEET në neovaskularizimin, ne kryem studime të neovaskularizimit in vivo. Pas 14 ditësh, minjtë e injektuar me qeliza endoteliale të parakulturuara me 10-8 M ose 10-5 M DEET treguan një rritje të konsiderueshme në përmbajtjen e hemoglobinës (Fig. 1c, shirita të bardhë).
Për më tepër, neovaskularizimi i induktuar nga DEET u studiua në minj me ksenograft U87MG, të cilët u injektuan çdo ditë (ip) me DEET në një dozë që dihet se shkakton përqendrime plazmatike prej 10-5 M, që është normale te njerëzit e ekspozuar. në 23. Tumoret e detektueshme (dmth. tumoret >100 mm3) janë vërejtur 14 ditë pas injektimit të qelizave U87MG në minj. Në ditën e 28, rritja e tumorit u rrit ndjeshëm në minjtë e trajtuar me DEET krahasuar me minjtë e kontrollit (Fig. 1d, katrorë). Për më tepër, ngjyrosja me CD31 e tumoreve tregoi se DEET rriti ndjeshëm zonën e kapilarëve, por jo densitetin e mikrovaseve. (Fig. 1e–g).
Për të përcaktuar rolin e receptorëve muskarinikë në proliferimin e induktuar nga DETA, u përdor 10-8 M ose 10-5 M DETA në prani të pFHHSiD (10-7 M, një antagonist selektiv i receptorit M3). Trajtimi i HUVEC. pFHHSiD bllokoi plotësisht vetitë proliferative të DETA në të gjitha përqendrimet (Tabela 1).
Në këto kushte, ne gjithashtu ekzaminuam nëse DEET do të rriste gjatësinë e kapilarëve në qelizat HUVEC. Në mënyrë të ngjashme, pFHHSiD parandaloi ndjeshëm gjatësinë e kapilarëve të shkaktuar nga DEET (Fig. 1a, b, shirita gri). Për më tepër, eksperimente të ngjashme u kryen me M3 siRNA. Megjithëse siRNA e kontrollit nuk ishte efektive në nxitjen e formimit të kapilarëve, heshtja e receptorit muskarinik M3 hoqi aftësinë e DEET për të rritur gjatësinë e kapilarëve (Fig. 1a, b, shirita të zinj).
Për më tepër, të dy vaskularizimi i induktuar nga 10-8 M ose 10-5 M DEET in vitro dhe neovaskularizimi in vivo u bllokuan plotësisht nga pFHHSiD (Fig. 1c, d, rrathët). Këto rezultate tregojnë se DEET promovon angiogjenezën përmes një rruge të ndjeshme ndaj antagonistëve selektivë të receptorit M3 ose siRNA M3.
AChE është objektivi molekular i DEET. Ilaçe të tilla si donepezil, të cilët veprojnë si frenues AChE, mund të stimulojnë angiogjenezën EC in vitro dhe në modelet e ishemisë së gjymtyrëve të pasme të miut14. Ne testuam efektin e dy përqendrimeve të DEET në aktivitetin e enzimës AChE në HUVEC. Përqendrimet e ulëta (10-8 M) dhe të larta (10-5 M) të DEET ulën aktivitetin e AChE endoteliale në krahasim me kushtet e kontrollit (Fig. 2).
Të dy përqendrimet e DEET (10-8 M dhe 10-5 M) reduktuan aktivitetin e acetilkolinesterazës në HUVEC. BW284c51 (10-5 M) u përdor si një kontroll për frenuesit e acetilkolinesterazës. Rezultatet shprehen si përqindje e aktivitetit AChE në HUVEC të trajtuar me dy përqendrimet e DEET krahasuar me qelizat e trajtuara me automjet. Vlerat shprehen si mesatare ± SEM e gjashtë eksperimenteve të pavarura. *p < 0,05 krahasuar me kontrollin (testi i krahasimit të shumëfishtë Kruskal-Wallis dhe Dunn).
Oksidi nitrik (NO) është i përfshirë në procesin angiogjenik 33, prandaj është studiuar prodhimi i NO në HUVEC-të e stimuluara nga DEET. Prodhimi i NO endotelial i trajtuar me DEET u rrit në krahasim me qelizat e kontrollit, por arriti domethënien vetëm në një dozë prej 10-8 M (Fig. 3c). Për të përcaktuar ndryshimet molekulare që kontrollojnë prodhimin e NO-së të induktuar nga DEET, shprehja dhe aktivizimi i eNOS u analizuan me Western blotting. Megjithëse trajtimi DEET nuk e ndryshoi shprehjen eNOS, ai rriti ndjeshëm fosforilimin eNOS në vendin e tij aktivizues (Ser-1177) ndërsa uli vendin e tij frenues (Thr-495) në krahasim me qelizat e patrajtuara në fosforilimin eNOS (Fig. 3d). Për më tepër, raporti i eNOS të fosforiluar në vendin e aktivizimit dhe vendin frenues u llogarit pas normalizimit të sasisë së eNOS të fosforiluar me sasinë totale të enzimës. Ky raport u rrit ndjeshëm në HUVEC-të e trajtuara me çdo përqendrim të DEET krahasuar me qelizat e patrajtuara (Fig. 3d).
Së fundi, shprehja e VEGF, një nga faktorët kryesorë proangiogjenik, u analizua me Western blotting. DEET rriti ndjeshëm shprehjen e VEGF, ndërsa pFHHSiD e bllokoi plotësisht këtë shprehje.
Meqenëse efektet e DEET janë të ndjeshme si ndaj bllokadës farmakologjike ashtu edhe ndaj rregullimit të receptorëve M3, ne testuam hipotezën se DEET mund të përmirësojë sinjalizimin e kalciumit. Çuditërisht, DEET nuk arriti të rrisë kalciumin citoplazmatik në HUVEC (të dhënat nuk tregohen) dhe HEK/M3 (Fig. 4a, b) për të dyja përqendrimet e përdorura.
Koha e postimit: Dhjetor-30-2024