Ilaçi anthelmintik N,N-dietil-m-toluamide (DEET) është raportuar se pengon AChE (acetilkolinesterazën) dhe ka veti të mundshme kancerogjene për shkak të vaskularizimit të tepërt. Në këtë punim, ne tregojmë se DEET stimulon në mënyrë specifike qelizat endoteliale që nxisin angiogjenezën, duke rritur kështu rritjen e tumorit. DEET aktivizon proceset qelizore që çojnë në angiogjenezë, duke përfshirë përhapjen, migrimin dhe ngjitjen. Kjo shoqërohet me rritjen e prodhimit të NO dhe shprehjen e VEGF në qelizat endoteliale. Heshtja e M3 ose përdorimi i frenuesve farmakologjikë të M3 eliminoi të gjitha këto efekte, duke sugjeruar që angiogjeneza e induktuar nga DEET është e ndjeshme ndaj M3. Eksperimentet që përfshijnë sinjalizimin e kalciumit në qelizat endoteliale dhe HEK që shprehin tepër receptorët M3, si dhe studimet e lidhjes dhe ankorimit, tregojnë se DEET vepron si një modulator allosterik i receptorëve M3. Për më tepër, DEET pengon AChE, duke rritur kështu biodisponueshmërinë e acetilkolinës dhe lidhjen e saj me receptorët M3, dhe duke rritur efektet proangiogjene përmes rregullimit allosterik.
EC-të primare u izoluan nga aorta e minjve zviceranë. Metoda e nxjerrjes u adaptua nga protokolli Kobayashi 26. EC-të murine u kultivuan në medium EBM-2 të plotësuar me 5% FBS të inaktivizuar nga nxehtësia deri në pasazhin e katërt.
Efekti i dy përqendrimeve të DEET në përhapjen e HUVEC, U87MG ose BF16F10 u analizua duke përdorur Kitin e Analizës së Përhapjes së Qelizave CyQUANT (Molecular Probes, C7026). Shkurtimisht, 5.103 qeliza për pus u mbjellën në një pllakë me 96 puseta, u lanë të ngjiteshin gjatë natës dhe më pas u trajtuan me DEET për 24 orë. Pas heqjes së mjedisit të rritjes, shtoni tretësirë lidhëse ngjyruesi në secilën pus të mikropllakës dhe inkuboni qelizat në 37 °C për 30 minuta. Nivelet e fluoreshencës u përcaktuan duke përdorur një lexues mikropllake shumëmodëshe Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Gjermani) të pajisur me filtra ngacmimi 485 nm dhe filtra emetimi 530 nm.
HUVEC u mbjellën në pllaka me 96 puseta me një dendësi prej 104 qelizash për pus. Qelizat u trajtuan me DEET për 24 orë. Qëndrueshmëria e qelizave u vlerësua duke përdorur një analizë kolorimetrike MTT (Sigma-Aldrich, M5655). Vlerat e dendësisë optike u morën në një lexues mikropllakash shumëmodëshe (Mithras LB940) në një gjatësi vale prej 570 nm.
Efektet e DEET u studiuan duke përdorur analiza të angiogjenezës in vitro. Trajtimi me 10-8 M ose 10-5 M DEET rriti formimin e gjatësisë kapilare në HUVEC (Fig. 1a, b, shirita të bardhë). Krahasuar me grupin e kontrollit, trajtimi me përqendrime DEET që varionin nga 10-14 në 10-5 M tregoi se gjatësia kapilare arriti një plato në 10-8 M DEET (Fig. plotësuese S2). Nuk u gjet asnjë ndryshim i rëndësishëm në efektin proangiogjenik in vitro të HUVEC-ve të trajtuara me DEET në diapazonin e përqendrimit prej 10-8 M dhe 10-5 M.
Për të përcaktuar efektin e DEET në neovaskularizim, ne kryem studime të neovaskularizimit in vivo. Pas 14 ditësh, minjtë të cilëve iu injektuan qeliza endoteliale të parakulturuara me 10-8 M ose 10-5 M DEET treguan një rritje të konsiderueshme të përmbajtjes së hemoglobinës (Fig. 1c, shirita të bardhë).
Për më tepër, neovaskularizimi i shkaktuar nga DEET u studiua te minjtë që mbanin ksenograft U87MG, të cilëve iu injektua çdo ditë (ip) DEET në një dozë të njohur për të shkaktuar përqendrime plazmatike prej 10-5 M, e cila është normale te njerëzit e ekspozuar. në 23. Tumoret e dallueshme (domethënë tumoret >100 mm3) u vunë re 14 ditë pas injektimit të qelizave U87MG te minjtë. Në ditën e 28-të, rritja e tumorit u rrit ndjeshëm te minjtë e trajtuar me DEET krahasuar me minjtë e kontrollit (Fig. 1d, katrorë). Për më tepër, ngjyrosja CD31 e tumoreve tregoi se DEET rriti ndjeshëm sipërfaqen kapilare, por jo dendësinë e mikroenëve të gjakut. (Fig. 1e–g).
Për të përcaktuar rolin e receptorëve muskarinikë në përhapjen e induktuar nga DETA, u përdor 10-8 M ose 10-5 M DETA në prani të pFHHSiD (10-7 M, një antagonist selektiv i receptorit M3). Trajtimi i HUVEC. pFHHSiD bllokoi plotësisht vetitë përhapëse të DETA në të gjitha përqendrimet (Tabela 1).
Në këto kushte, ne shqyrtuam gjithashtu nëse DEET do të rriste gjatësinë kapilare në qelizat HUVEC. Në mënyrë të ngjashme, pFHHSiD parandaloi ndjeshëm gjatësinë kapilare të induktuar nga DEET (Fig. 1a, b, shirita gri). Për më tepër, eksperimente të ngjashme u kryen me siRNA M3. Edhe pse siRNA kontrolli nuk ishte efektive në nxitjen e formimit të kapilarëve, heshtja e receptorit muskarinik M3 eliminoi aftësinë e DEET për të rritur gjatësinë kapilare (Fig. 1a, b, shirita të zinj).
Për më tepër, si vaskularizimi in vitro ashtu edhe neovaskularizimi i induktuar nga DEET me 10-8 M ose 10-5 M u bllokuan plotësisht nga pFHHSiD (Fig. 1c, d, rrathë). Këto rezultate tregojnë se DEET nxit angiogjenezën përmes një rruge të ndjeshme ndaj antagonistëve selektivë të receptorit M3 ose siRNA-së M3.
AChE është shënjestra molekulare e DEET. Barna të tilla si donepezili, të cilat veprojnë si frenues të AChE, mund të stimulojnë angiogjenezën e EC in vitro dhe në modelet e ishemisë së gjymtyrëve të pasme të miut14. Ne testuam efektin e dy përqendrimeve të DEET në aktivitetin enzimatik AChE në HUVEC. Përqendrimet e ulëta (10-8 M) dhe të larta (10-5 M) të DEET ulën aktivitetin endotelial të AChE krahasuar me kushtet e kontrollit (Fig. 2).
Të dy përqendrimet e DEET (10-8 M dhe 10-5 M) ulën aktivitetin e acetilkolinesterazës në HUVEC. BW284c51 (10-5 M) u përdor si kontroll për frenuesit e acetilkolinesterazës. Rezultatet shprehen si përqindje e aktivitetit AChE në HUVEC të trajtuar me dy përqendrimet e DEET krahasuar me qelizat e trajtuara me mjet. Vlerat shprehen si mesatare ± SEM e gjashtë eksperimenteve të pavarura. *p < 0.05 krahasuar me kontrollin (testi krahasues i shumëfishtë Kruskal-Wallis dhe Dunn).
Oksidi nitrik (NO) është i përfshirë në procesin angiogjenik 33, prandaj, u studiua prodhimi i NO në HUVEC-et e stimuluara nga DEET. Prodhimi i NO endoteliale i trajtuar me DEET u rrit në krahasim me qelizat kontrolluese, por arriti rëndësi vetëm në një dozë prej 10-8 M (Fig. 3c). Për të përcaktuar ndryshimet molekulare që kontrollojnë prodhimin e NO të induktuar nga DEET, shprehja dhe aktivizimi i eNOS u analizuan me Western blotting. Megjithëse trajtimi me DEET nuk ndryshoi shprehjen e eNOS, ai rriti ndjeshëm fosforilimin e eNOS në vendin e tij të aktivizimit (Ser-1177) ndërsa uli vendin e tij frenues (Thr-495) krahasuar me qelizat e patrajtuara në fosforilimin e eNOS (Fig. 3d). Për më tepër, raporti i eNOS-it të fosforiluar në vendin e aktivizimit dhe vendin frenues u llogarit pas normalizimit të sasisë së eNOS-it të fosforiluar me sasinë totale të enzimës. Ky raport u rrit ndjeshëm në HUVEC-et e trajtuara me çdo përqendrim të DEET krahasuar me qelizat e patrajtuara (Fig. 3d).
Së fundmi, shprehja e VEGF, një nga faktorët kryesorë proangiogjenikë, u analizua me anë të Western blotting. DEET rriti ndjeshëm shprehjen e VEGF, ndërsa pFHHSiD e bllokoi plotësisht këtë shprehje.
Meqenëse efektet e DEET janë të ndjeshme si ndaj bllokimit farmakologjik ashtu edhe ndaj uljes së receptorëve M3, ne testuam hipotezën se DEET mund të rrisë sinjalizimin e kalciumit. Çuditërisht, DEET dështoi të rriste kalciumin citoplazmatik në HUVEC (të dhënat nuk janë paraqitur) dhe HEK/M3 (Fig. 4a, b) për të dy përqendrimet e përdorura.
Koha e postimit: 30 dhjetor 2024