Pesticidet luajnë një rol kritik në adresimin e mungesave globale të ushqimit dhe në luftimin e sëmundjeve njerëzore të transmetuara nga vektorët. Megjithatë, problemi në rritje i rezistencës ndaj pesticideve kërkon urgjentisht zbulimin e komponimeve të reja që synojnë objektiva të nën-shfrytëzuara. Kanalet e potencialit të receptorit kalimtar të insekteve (TRPV) - Nanzhong (Nan) dhe joaktive (Iav) - mund të formojnë kanale heterologe (Nan-Iav) dhe të lokalizohen në organet mekanoshisore që ndërmjetësojnë gjeotropizmin, dëgjimin dhe proprioceptimin tek insektet. Disa pesticide, të tilla si afidopirolidoni (AP), synojnë Nan-Iav përmes mekanizmave të panjohur. AP është efektiv kundër insekteve shpuese-thithëse (hemipteranët), duke parandaluar ushqyerjen duke prishur funksionin e filamenteve. AP mund të lidhet vetëm me Nan, por vetëm Nan-Iav mund të bashkëveprojë me agonistë, duke përfshirë nikotinamidin endogjen (NAM), duke shfaqur kështu aktivitetin e kanalit. Pavarësisht potencialit të Nan-Iav si një objektiv insekticidi, dihet pak për montimin e kanalit të tij, vendet e lidhjes rregullatore dhe rregullimin e varur nga Ca2+, duke penguar zhvillimin e mëtejshëm të insekticideve. Në këtë studim, mikroskopia krio-elektronike u përdor për të përcaktuar strukturën e Nan-Iav në insektet Hemiptera në gjendjen pa kalmodulinë-ligand, si dhe me AP dhe NAM në kufirin e domenit citoplazmatik të përsëritjes së ankirinës (ARD). Çuditërisht, zbuluam se vetë proteina Nan mund të formojë një pentamer, i cili stabilizohet nga ndërveprimet ARD të ndërmjetësuara nga AP. Ky studim zbulon ndërveprimet molekulare midis insekticideve dhe agonistëve dhe Nan-Iav, duke theksuar rëndësinë e ARD në funksionin dhe montimin e kanalit, dhe duke eksploruar mekanizmin e rregullimit të Ca2+.
Në sfondin e ndryshimeve klimatike globale gjithnjë e më të rënda, përkeqësimi i sigurisë ushqimore globale është një nga sfidat kryesore të shekullit të 21-të, me pasoja të shumta për shoqërinë.1,2Raporti i Organizatës Botërore të Shëndetësisë për Gjendjen e Sigurisë Ushqimore dhe të Ushqyerjes në Botë 2023 (SOFI) vlerëson se afërsisht 2.33 miliardë njerëz në të gjithë botën vuajnë nga pasiguri ushqimore e moderuar deri në të rëndë, një problem i hershëm.3,4Fatkeqësisht, rreth 20% deri në 30% ose më shumë e rendimenteve të të korrave humbasin çdo vit për shkak të dëmtuesve dhe patogjenëve, dhe ngrohja globale pritet të përkeqësojë rezistencën ndaj dëmtuesve dhe cenueshmërinë e të korrave.4,5,6,7,8Zhvillimi i pesticideve është thelbësor jo vetëm për të mbrojtur të korrat nga dëmtuesit dhe për të zvogëluar përhapjen e patogjenëve që përhapen nga vektorët, por edhe për të luftuar sëmundjet njerëzore që përhapen nga vektorët, të tilla si ethet e dengut, malaria dhe sëmundja Chagas, të cilat janë gjithnjë e më rezistente ndaj pesticideve.5,9,10,11
Ndër shënjestrat kryesore të insekticideve neurotoksike, kanali heterotetramerik TRPV Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) përfaqëson një klasë shënjestrash insekticidesh të zbuluara vetëm në dekadën e fundit, duke përfshirë insekticide të disponueshme komercialisht si imidaklopridi dhe piraklostrobina.12,13,14Insekticidi gjysmësintetik aphidopyrrolifen (AP) është një produkt i zhvilluar dhe i komercializuar së fundmi, përbërësi kryesor i të cilit është insekticidi aktiv Inscalis®, i cili lidhet me AP në një nivel aktiviteti subnanomolar.15AP shfaq toksicitet të ulët akut ndaj pjalmuesve, insekteve të dobishme dhe organizmave të tjerë jo-target, dhe kur përdoret sipas udhëzimeve të etiketës, mund të zvogëlojë presionin e rezistencës ndaj insekticideve të tjera.16,17,18Nan dhe Iav janë të shpërndara gjerësisht në të gjitha llojet e insekteve, shprehen bashkë vetëm në neuronet e receptorëve të shtrirjes kordale të antenave dhe gjymtyrëve, dhe janë kritike për dëgjimin, perceptimin e gravitetit dhe proprioceptimin.13,16,19,20,21,22AP, imidaklopridi dhe piraklostrobina stimulojnë kompleksin Nan-Iav përmes një mekanizmi unik, duke penguar në fund të fundit transduksionin e sinjalit proprioceptiv.13,16,23Tek insektet shpuese-thithëse (hemipteranët) siç janë afidet dhe mizat e bardha, humbja e proprioceptimit dëmton aftësinë e tyre të ushqyerjes, duke çuar në fund në vdekje.13,24Është interesante që AP shfaq afinitet të lartë për kompleksin Nan-Iav dhe afinitet të ulët për vetëm Nan. Lidhja e AP me Nan-Iav shkakton një rrymë elektrike, por lidhja vetëm me Nan nuk stimulon aktivitetin e kanalit. Vetë Iav nuk lidhet fare me AP.16Kjo sugjeron që Nan dhe Iav mund të lidhen për të formuar komplekse të ndryshme kanalesh Nan-Iav (p.sh., me raporte të ndryshme stekiometrike ose rregullime të ndryshme brenda të njëjtit raport stekiometrik) ose që AP mund të lidhet në vende të shumëfishta. Për më tepër, nikotinamide natyrale agoniste (NAM) lidhet me Drosophila Nan-Iav me afinitet mikromolar, duke shfaqur efekte të ngjashme me ato të afideve (AP) in vitro.16,25dhe duke penguar riprodhimin dhe ushqyerjen e afideve, duke çuar në fund në vdekjen e tyre25,26Këto të dhëna ngrenë shumë pyetje. Për shembull, mbetet e paqartë se si formohet heterodimeri Nan-Iav, cilat vende lidhëse përdoren për të moduluar molekulat e vogla dhe si këto molekula të vogla rregullojnë funksionin e kanalit duke shtypur propriocepsionin. Për më tepër, arsyet pse vetë Nan është joaktive dhe ka afinitet të ulët për AP, ndërsa heterodimeri Nan-Iav është aktiv dhe lidhet me AP me afinitet më të lartë, mbeten të paqarta. Së fundmi, dihet pak rreth rregullimit të varur nga Ca2+ të funksionit Nan-Iav dhe se si ai integrohet në proceset e sinjalizimit neuronal.13,21
Në këtë studim, duke kombinuar mikroskopinë krio-elektronike, elektrofiziologjinë dhe teknikat e lidhjes së radioligandit, ne sqaruam montimin e Nan-Iav dhe mekanizmin e lidhjes së tij me rregullatorët e molekulave të vogla. Për më tepër, ne zbuluam kalmodulinë (CaM) të lidhur në mënyrë konstitutive me Iav dhe pentamerë Nan të stabilizuar me AP. Këto rezultate ofrojnë njohuri të rëndësishme mbi rregullimin e joneve të kalciumit në kanale, montimin e kanaleve dhe faktorët që përcaktojnë afinitetin e lidhjes së ligandit. Më e rëndësishmja, ne konfirmuam se ARD luan një rol qendror në këto procese. Studimi ynë i kanaleve të plota të insekteve të lidhura me pesticide bujqësore përkatëse.27, 28, 29hap perspektiva për zhvillimin e industrisë së pesticideve, duke përmirësuar efikasitetin dhe specifikën e pesticideve dhe duke mundësuar aplikimin e komponimeve të synuara ndaj TRPV-së në specie të tjera për të adresuar sigurinë globale ushqimore dhe përhapjen e sëmundjeve të transmetuara nga vektorët.
Gjithashtu zbuluam se Nan-Iav rregullohet nga Ca2+, dhe mekanizmi i rregullimit ndërmjetësohet nga CaM i lidhur në mënyrë konstitutive. Është e rëndësishme të theksohet se ky rregullim i varur nga Ca2+ i Nav nga CaM ndryshon ndjeshëm nga mekanizmat e rregullimit të kanaleve të tjera jonike (p.sh., kanalet Na+ të varura nga voltazhi dhe kanalet TRPV5/6).52,53,54,55,56,57Në kanalin Nav1.2, domeni C-terminal i CaM lidhet në mënyrë helikoidale me domenin C-terminal (CTD), dhe Ca2+ shkakton lidhjen e domenit të tij N-terminal me pjesën distale të CTD.56Në kanalin TRPV5/6, domeni C-terminal i CaM lidhet me CTH, dhe Ca2+ shkakton zgjatje lart të domenit të tij N-terminal në pore, duke bllokuar kështu përshkueshmërinë e kationeve.53,54Ne propozojmë një model për funksionin e rregulluar nga Ca2+ të Nan-Iav-CaM (Fig. 4h). Në këtë model, domeni N-terminal i CaM lidhet në mënyrë konstitutive me domenin C-terminal (CTH) të Iav. Në gjendjen e qetësisë (përqendrim i ulët [Ca2+]), domeni C-terminal i CaM bashkëvepron me Nan, duke stabilizuar konformacionin ARD dhe duke nxitur kështu hapjen e kanalit. Lidhja e një agonisti/insekticidi në kanal shkakton hapjen e poreve, duke çuar në fluksin e Ca2+. Ca2+ më pas lidhet me CaM, duke shkaktuar shkëputje të domenit C-terminal nga ARD e Nan. Meqenëse bllokimi i lidhjes së CaM në thelb eliminon efektin frenues të Ca2+, ky shkëputje modulon lëvizshmërinë e ARD, duke shkaktuar kështu frenim ose desensitizim të varur nga Ca2+. Rimëkëmbja e shpejtë e rrymave të kanalit pas elucionit të jonit të kalciumit (Fig. 4g) sugjeron që ky mekanizëm lehtëson përgjigjet e shpejta ndaj sinjaleve neuronale të ndërmjetësuara nga Ca2+. Për më tepër, rajoni C-terminal i Iav, i cili mbetet ende pak i kuptuar, është raportuar se luan role të tjera në synimin e kanalit dhe rregullimin aktual.21
Së fundmi, studimi ynë paraqet strukturën me rezolucion të lartë të një kompleksi kanali TRP insekticid-insekticid me rëndësi bujqësore - një zbulim i panjohur më parë për ne. Veçanërisht, ne karakterizuam strukturën dhe funksionin e kanalit të insekteve në qelizat njerëzore (HEK293S GnTi–) në vend të qelizave të insekteve. Përballë rezistencës në rritje ndaj insekticideve dhe presionit të vazhdueshëm mbi sigurinë ushqimore dhe patogjenët, puna jonë ofron informacione të rëndësishme që do të lehtësojnë zhvillimin e insekticideve të reja në dobi të shëndetit të njeriut dhe sigurisë globale ushqimore. Studimet kanë treguar se insekticidet si AP janë efektive kundër disa dëmtuesve kur përdoren sipas udhëzimeve të etiketës dhe kanë toksicitet të ulët akut ndaj pjalmuesve të dobishëm, duke demonstruar sigurinë e tyre mjedisore.13,16Për më tepër, testimi i disa derivateve të AP-së te mushkonjat ka treguar se ato përfundimisht humbasin aftësinë e tyre për të fluturuar. Të kuptuarit se si këto komponime moduluese lidhen me Nan-Iav do të lehtësojë modifikimin e komponimeve ekzistuese ose zhvillimin e komponimeve të reja për një efekt më efektiv dhe...i saktëkontrolli i dëmtuesve. Studimi ynë tregon se ndërfaqja Nan-Iav ARD është kritike jo vetëm për rregullimin e aktivitetit të komponimeve endogjene, pesticideve dhe Ca2+-CaM, por edhe për montimin e kanaleve. Ne sugjerojmë që ndërprerja e montimit të heterodimerit me molekula të vogla mund të jetë një qasje unike dhe premtuese për zhvillimin e frenuesve të kanaleve jonik.
Nga tetë gjenet ortologe, u zgjodhën gjenet me gjatësi të plotë të brumbullit kafe (Halyomorpha halys) Nanchung dhe Inactive, të cilat shfaqën stabilitet të shkëlqyer në detergjentë. Gjenet e sintetizuara u optimizuan për kodone për shprehje njerëzore dhe u klonuan në vektorin pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) duke përdorur vendet e kufizimit XhoI dhe EcoRI. Kjo siguroi që klonet të ishin në kornizë me etiketat C-terminale GFP-FLAG-10xHis dhe mCherry-FLAG-10xHis, të cilat çahen nga proteaza HRC-3C (PPX), duke lejuar një proces të pavarur.shprehjePrajmerët e përdorur për të klonuar Nanchung dhe Inactive në vektorin pBacMam ishin si më poshtë:
Imazhet mikroskopike të grimcave individuale u morën në një mikroskop elektronik transmetues (FEI) Titan Krios G2 të pajisur me një kamera K3 dhe një filtër energjie Gatan BioQuantum. Mikroskopi funksionoi në 300 keV, me një cilësim energjie prej 20 eV, një madhësi pikseli të mostrës prej 1.08 Å/piksel (zmadhim nominal prej 81,000x) dhe një gradient defokusi që varionte nga -0.8 në -2.2 μm. Regjistrimi video u krye me 40 kuadro për sekondë duke përdorur një mikroskop Latitude S (Gatan) me një shkallë doze nominale prej 25 e–px−1 s−1, një kohë ekspozimi prej 2.4 s dhe një dozë totale prej afërsisht 60 e–Å−2.
Korrigjimi i lëvizjes së induktuar nga rrezja dhe peshimi i dozës u kryen në film duke përdorur MotionCor2 në RELION 4.061. Vlerësimi i parametrave të funksionit të transferimit të kontrastit (CTF) u krye në cryoSPARC duke përdorur metodën e vlerësimit CTF të bazuar në copëza62. Fotomikrografitë me një rezolucion përshtatjeje CTF ≥4 Å u përjashtuan nga analiza pasuese. Në mënyrë tipike, një nëngrup prej 500-1000 fotomikrografish u përdor për përzgjedhjen e pikave në cryoSPARC, e ndjekur nga disa raunde klasifikimi 2D pas filtrimit për të marrë një imazh të qartë referimi për përzgjedhjen e grimcave të bazuara në shabllon. Grimcat u nxorën më pas duke përdorur kuti kufizuese 64-pikselëshe dhe grupim 4-fish. U kryen disa raunde klasifikimi 2D për të hequr kategoritë e padëshiruara të grimcave. Modeli fillestar 3D u rindërtua duke përdorur rindërtimin ab initio dhe u rafinua duke përdorur rafinim jo-uniform në cryoSPARC. Klasifikimi 3D u krye në cryoSPARC ose RELION bazuar në heterogjenitetin e ARD. Nuk u vu re heterogjenitet i rëndësishëm i domeneve të membranës. Grimcat u rafinuan duke përdorur metodat C1 dhe C2; grimcat me rezolucion më të lartë C2 u konsideruan simetrike në lidhje me C2 dhe u importuan në RELION për rafinim Bayesian. Grimcat më pas u transferuan përsëri në cryoSPARC për rafinim përfundimtar jo-uniform dhe lokal. Rezolucioni përfundimtar dhe numërimi i grimcave tregohen në Tabelën 1.
Gjatë përpunimit të pentamerëve Nan+AP, ne eksploruam metoda të ndryshme për përmirësimin e rezolucionit të domeneve të membranës (veçanërisht rajonit të poreve), siç është zbritja e sinjalit dhe maskimi i TMD-së. Megjithatë, këto përpjekje ishin të pasuksesshme për shkak të çrregullimit potencialisht ekstrem në rajonin e poreve dhe heterogjenitetit të përgjithshëm të TMD-së. Rezolucioni përfundimtar u llogarit duke përdorur një maskë të gjeneruar automatikisht nga metoda e përpunimit jo-uniform në cryoSPARC, duke synuar kryesisht rajonin ARD. Kjo arriti rezolucion dukshëm më të lartë se ai i domeneve të membranës (veçanërisht rajonit VSLD).
Modelet fillestare de novo të formave apo të baktereve Nanchung dhe Inactive u gjeneruan për herë të parë duke përdorur Coot63, dhe modelet e baktereve Nan dhe Iav u gjeneruan duke përdorur AlphaFold264 për të identifikuar rajonet me besim të ulët. Modelimi i kalmodulinës u bazua në përshtatjet e trupit të ngurtë të modeleve që lidhen me Ca2+ dhe pa Ca2+ në akseset PDB 4JPZ56 dhe 1CFD65, përkatësisht. Modelet u rafinuan duke përdorur rafinim sferik për të siguruar stereokiminë e saktë dhe gjeometrinë e mirë. Fosfatidilkolina, fosfatidiletanolamina dhe fosfatidilserina u modeluan më pas si dendësi lipidike të përcaktuara mirë, dhe ligandët NAM dhe AP u vendosën në dendësitë përkatëse në kryqëzimet e ngushta. Skedarët e kufizimeve u gjeneruan nga vargu SMILES i izoformave duke përdorur eLBOW në PHENIX66. Së fundmi, modelet u rafinuan në hapësirë reale në PHENIX duke përdorur kërkimin lokal të rrjetit dhe minimizimin global me kufizime të strukturës sekondare. Serveri MolProbity u përdor për rafinimin e modelit dhe analizën strukturore, dhe ilustrimet u kryen duke përdorur PyMOL dhe UCSF Chimera X. 67,68,69 Analiza e aperturës u krye duke përdorur serverin HOLE,70 dhe hartëzimi i ruajtjes së sekuencës u krye duke përdorur serverin Consurf.71
Analiza statistikore u krye duke përdorur Igor Pro 6.2, Excel Office 365 dhe GraphPad Prism 7.0. Të gjitha të dhënat sasiore paraqiten si mesatare ± gabim standard (SEM). Testi t i Studentit (dykahësh, i paçiftuar) u përdor për të krahasuar dy grupe. Analiza njëkahëshe e variancës (ANOVA) e ndjekur nga testi post hoc i Dunnett u përdor për të krahasuar grupe të shumëfishta. *P< 0.05, **P< 0.01, dhe ***P< 0.001 u konsideruan statistikisht të rëndësishme në varësi të shpërndarjes së të dhënave. Vlerat Kd, Ki dhe intervalet e tyre asimetrike të besimit 95% u llogaritën duke përdorur GraphPad Prism 10.
Për më shumë detaje mbi metodologjinë e studimit, ju lutemi shihni Përmbledhjen e Raportit të Portofolit të Natyrës të lidhur në këtë artikull.
Modeli fillestar u ndërtua duke përdorur modelet e kalmodulinës nga bazat e të dhënave PDB 4JPZ dhe 1CFD. Koordinatat janë depozituar në Bankën e të Dhënave të Proteinave (PDB) me numrat e hyrjes 9NVN (Nan-Iav-CaM pa ligand), 9NVO (Nan-Iav-CaM i lidhur me nikotinamidën), 9NVP (Nan-Iav-CaM i lidhur me nikotinamidën dhe EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM i lidhur me afenidolpirolinë dhe kalcium), 9NVR (Nan-Iav-CaM i lidhur me afenidolpirolinë dhe EDTA) dhe 9NVS (Penteamer Nan i lidhur me afenidolpirolinë). Imazhet përkatëse të mikroskopisë krio-elektronike janë depozituar në Bazën e të Dhënave të Mikroskopisë Elektronike (EMDB) nën numrat e mëposhtëm të hyrjes: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM pa ligand), EMD-49845 (Kompleksi Nan-Iav-CaM me nikotinamid), EMD-49846 (Kompleksi Nan-Iav-CaM me nikotinamid dhe EDTA), EMD-49847 (Kompleksi Nan-Iav-CaM me afidopirolinë dhe kalcium), EMD-49848 (Kompleksi Nan-Iav-CaM me afidopirolinë dhe EDTA) dhe EMD-49849 (Kompleksi Nan pentamer me afidopirolinë). Të dhënat e papërpunuara për analizën funksionale paraqiten në këtë punim.
Koha e postimit: 28 janar 2026